嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）MIP基因克隆、重组、表达和蛋白纯化方法

摘要：

本发明涉及一种嗜肺军团菌Legionella pneumophila macrophage infectivity potentiator MIP基因的克隆、重组、表达、纯化方法与专用引物，以及MIP蛋白及其类似物、衍生物在军团菌感染病人的临床诊断和治疗方面的应用。本方法将获得的嗜肺军团菌(Legionalla Neomaphalla)MIP基因组DNA，用PCR方法获得MIP基因，并将该基因重组后克隆到大肠杆菌表达载体中，诱导表达后提取MIP蛋白，进而应用亲和层析方法得到高纯度的蛋白，为临床进一步诊断嗜肺军团菌感染应用于检测嗜肺军团菌抗原和抗体。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN200410006363.2

申请日期：2004-03-01

公开/公告号：CN1664105

公开/公告日：2005-09-07

主分类号：C12N15/31

申请/专利权人:天津瑞爱金生物科技有限公司

发明/设计人:杨建国;王金良;李晓眠;张楷

主申请人地址:300080天津市华苑产业区二纬路6号F座7门301室

国别省市代码:天津;12

权利要求：

1、一种表达纯化嗜肺军团菌MIP基因和重组嗜肺军团菌MIP的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)、克隆嗜肺军团菌MIP的基因，用PCR法扩增嗜肺军团菌MIP的基因；(2)、将上述扩增的嗜肺军团菌MIP基因与克隆载体连接，构建嗜肺军团菌MIP克隆质粒；(3)、将上述嗜肺军团菌MIP克隆质粒亚克隆进表达载体，再将连接后的质粒DNA转染大肠杆菌；(4)、表达嗜肺军团菌MIP蛋白。a、将上述带有嗜肺军团菌MIP基因的表达载体的大肠杆菌接种含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；b、从板上选一个菌落，接种LB培养基(含有抗生素)瓶内，在37℃摇箱内培养，测菌液A650OD值为0.6-0.8时停止培养；c、向菌液内加IPTG，使其终浓度为0.5mM，继续培养4-6小时；d、收获细菌；(5)、纯化嗜肺军团菌MIP蛋白。a、将上述细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；b、超声裂解细菌，离心，将沉淀加8M尿素悬浮，离心，取上清液；c、纯化人用离子交换和Ni-NTG-His柱亲和层析进行纯化。