从甘蔗的嫩叶中提取过氧化物酶的方法
过氧化物酶(POD)提取方法，以甘蔗嫩叶为原料，以预冷的磷酸钾缓冲液匀浆、过滤，上清液用硫酸铵分级分离，冻干成粗酶。用预冷的磷酸钾缓冲液溶解沉淀并对重蒸馏水透析，离心，上清液用－15℃酒精沉淀，静置后，在冰冻离心机中离心收集沉淀，将沉淀溶于少量缓冲溶液中，透析除酒精。透析液经Sephadex G－100柱层析、洗脱液浓缩，可得部分纯酶。本方法可生产出R2＝3的高纯度的过氧化物酶，作为标记酶使用。原料来源广、廉价。
发明专利
CN02114970.4
2002-03-18
CN1369557
2002-09-18
C12N9/08
华南农业大学
何平;傅雪琳;高向阳;徐凤彩
510642广东省广州市天河五山
广州粤高专利代理有限公司
伍宏达
广东;44
权利要求书1、从甘蔗的嫩叶中提取过氧化物酶的方法，其特征在于以甘蔗嫩叶为原料，原料清洁后，加入预冷4℃的0.05mol/L pH＝7.0磷酸钾抽提液匀浆抽提；原料与抽提液的比例为1∶2(重量与体积比)，匀浆后过滤，弃去滤渣，取滤液，于滤液中加入固体硫酸铵，边加边搅拌至饱和度达40％，置0-4℃下静置后以4000rpm离心；弃沉淀得清液，在清液中再加入固体硫酸铵，边加边搅拌至饱和度达80％，置0-4℃下静置后以4000rpm离心；弃清液，得沉淀物，沉淀物即为粗酶；于粗酶中加入4℃的0.05mol/L pH＝7.0磷酸钾缓冲液，粗酶与缓冲液加入量的比例为1-2∶50(g/v)，装入透析袋中，放入重蒸馏水在4℃下透析直至硫酸铵透析完毕为止；透析后于4000rpm离心，弃沉淀，所得的上清液置于冰浴中，不断搅拌，慢慢加入1倍体积预冷至-15℃乙醇溶液，静置后4000rpm离心，弃去沉淀，于上清液再加入原上清液的1倍体积-15℃乙醇溶液，静置后4000rpm离心，收集沉淀，将沉淀溶于预冷4℃的0.05mol/L pH＝7.0磷酸钾缓冲液中，在重蒸馏水中透析除去乙醇。可得到R2值近于1的酶溶液；将酶溶液经Sephadex G-100层析柱层析，用pH6.8 0.02mol/L磷酸钾缓冲液洗脱，自动部分收集器收集，恒流泵恒流，收集呈酶活性的洗脱液，将洗脱液在4℃下超滤，冻干，即为纯酶制剂。