一种固相载体上校读PCR检测基因突变的方法

摘要：

本发明公开了一种固相载体上校读PCR检测基因突变的方法，设计引物，经二硫化物和磷酸修饰处理后，固定于普通载玻片，进行固相PCR反应；在PCR过程中，利用DNA多聚酶的3’－5’外切酶活性，实现突变基因的固相有效扩增，PCR过程中掺入生物素，扩增产物用酶标方法进行原位检测。本发明可对同一基因多个突变发生位点进行同步检测，对多个不同基因的基因突变情况进行检查，检测速度快，灵敏度高，操作简便，成本低，可用于细菌耐药性、遗传病等的临床检测。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN01133630.7

申请日期：2001-11-02

公开/公告号：CN1348993

公开/公告日：2002-05-15

主分类号：C12Q1/68

申请/专利权人:中国科学院武汉病毒研究所

发明/设计人:张先恩;邓教宇;张治平;文继开;陆红兵;刘强;刘虹;谢卫红;谢斌

主申请人地址:430071湖北省武汉市武昌小洪山中区44号

专利代理机构:武汉科宏专利事务所

代理人:王敏锋

国别省市代码:湖北;42

权利要求：

权利要求书1、一种固相载体上校读PCR检测基因突变的方法，它包括下列步骤：A.根据目标基因，设计一对外引物和内引物，后者与基因突变热点相对应，对内引物的两个末端分别进行二硫化物和磷酸化修饰；B.对普通载玻片进行巯基硅烷化修饰，固定突变热点对应引物；C.选用pfu高保真DNA多聚酶，优化反应条件为：20mM Tris-HCl pH 8.3，20mMKCl，1mM MgCl2，0.1mg/ml BSA，50μM dNTPs；使酶的外切酶活性达到最佳；D.使用高保真酶，以外引物为液相引物，以临床样品为模板，在相同条件下对内引物进行固相半巢式PCR，特异性扩增突变位点对应内引物，在扩增过程中掺入生物素；E.运用酶标技术，对扩增结果进行原位信号检测，封阻液进行室温封阻15分钟，甩干，亲和素标记碱性磷酸酶室温作用15分钟，漂洗液漂洗两次，15分钟/次，底物缓冲液漂洗5分钟，甩干，加底物NBT/BCIP，37℃显色30分钟。