一种零背景高通量定向表达克隆的方法

摘要：

本发明提出了一种零背景、高通量、定向克隆表达的方法，它是基于特定限制性内切酶双酶切表达载体，利用T₄DNA聚合酶消化经特殊设计的引物扩增的PCR产物，然后将PCR产物定向克隆到表达载体上的方法。特定的限制性内切酶可以是CpoI、NotI、EarI、SapI、StyI中的任两种(同种或异种)。本发明可与目前报道的所有基于PCR建库的方法相容，能做到零背景，高通量定向克隆，且实验周期短，成本低，适合于以细菌、真菌、动物、植物等作为宿主的高通量克隆和表达。是一个非常经济的克隆方法。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN01133518.1

申请日期：2001-09-30

公开/公告号：CN1341748

公开/公告日：2002-03-27

主分类号：C12N15/63

申请/专利权人:湖北大学

发明/设计人:马立新;蒋思婧

主申请人地址:430062湖北省武汉市武昌区宝集安

专利代理机构:武汉楚天专利事务所

代理人:丁齐旭

国别省市代码:湖北;42

权利要求：

权利要求书1、一种零背景、高通量、定向克隆表达的方法，主要包括一个表达载体和经PCR引物扩增的目的基因，其特征在于在表达载体中引入了两个特殊限制性内切酶酶切位点序列和一个致死基因表达单元；在扩增目标基因一对PCR引物的5′端分别引进了3～5个特定的碱基，在dATP(或dGTP或dCTP或dTTP)存在的条件下，扩增产物经T4DNA聚合酶消化后产生的粘性末端与载体双酶切得到的粘性末端匹配，从而可以定向克隆在经两个特殊的限制性内切酶双酶切的载体上。