抗菌肽毕赤酵母的制备与应用
柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌作用。根据天然抗菌肽A的1－11位氨基酸序列及抗菌肽D的12－37位氨基酸序列，设计抗菌肽AD基因，克隆于毕赤酵母中表达。经优化培养基配方和培养条件，在发酵罐中达到高密度培养及高效表达(5000单位/毫升)。将抗菌肽酵母制品按5000单位/kg添加于仔猪饲料中，或以60－100单位/日·头添加于雏鸡饮水中，能预防与治疗禽畜腹泻，可代替部分抗生素作为饲料添加剂。
发明专利
CN01112278.1
2001-04-03
CN1322815
2001-11-21
C12N1/19
深圳市艺鹏生物工程有限公司
黄自然;黄亚东;郑青;姚汝华
518031广东省深圳市深南中路1027号新城大厦西座9楼
长春科宇专利代理有限责任公司
李恩庆%马守忠
广东;44
权利要求书1、抗菌肽毕赤酵母的制备，其特征在于：根据柞蚕天然抗菌肽设计抗菌肽AD氨基酸序列：将第1-11位氨基酸设计为柞蚕抗菌肽A序列，将第12-37位氨基酸设计为柞蚕抗菌肽D序列；用DNA合成仪合成含82个碱基的F1多聚脱氧核糖核苷酸片段和含78个碱基F2多聚脱氧核糖核苷酸片段，它们之间有20个碱基互补；设计合成引物1:5′GGATCCGTATGAAATGGAAG 3′引物2:3′TCATTATTCTTAAGCAGGCTG 5′通过F1、F2和引物1、2，用PCR(聚合酶链反应)方法合成具有134个碱基对的抗菌肽AD基因；将抗菌肽AD基因与pCRTM2.1质粒(T载体)用T4DNA连接酶连接构建成pCRCAD重组质粒；用pCRCAD重组质粒转化大肠杆菌JM109，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和溴氯吲哚半乳糖苷(X-gal)筛选获得含重组质粒pCRCAD1的转化子；采用点突变方法，使第37位的赖氨酸(AAG)改造成天门冬酰胺(AAC)；设计合成引物AB:引物A:5′GAGCTC GAGATGAAATGGAAGTTGTTCAAAAAG 3′引物B:3′CGA GTT CGA TGA CGG AAC CGA TTC TTG ATT CTT AAGCCG CCG 5′以pCRCAD质粒为模板加入引物A及B,PCR扩增得到改造后的抗菌肽基因命名为抗菌肽CAD，其DNA序列是M K W K L F K K I E K5′GAG CTC GAG ATG AAA TGG AAG TTG TTC AAA AAG ATT CAA AAG3′CTC GAG CTC TAC TTT ACC TTC AAC AAG TTT TTC TAA GTT TTCK V G Q R V R D A V IAAG GTT GGT CAA AGA GTT AGA GAC GCT GTC ATCTTC CAA CCA GTT TCT CAA TCT CTG CGA CAG GTTS A G P A V A T V A QTCT GCT GGT GCT GCT GTT GCC ACT GTT GCT CAAAGA CGA CCA CGA CGA CAA CGG TGA CAA CGA GTTA T A L A NGCT ACT GCC TTG GCT AAC TAA GAA TTC GGC GGC3′CGA TGA CGG AAC CGA TTG ATT CTT AAG CCG CCG5′以抗菌肽CAD基因与pHIL-S1质粒重组转化于大肠杆菌DH5α，在氨苄青霉素抗性基因筛选到转化子pHIL-CAD5，测序结果为141碱基对(bp)；将抗菌肽CAD基因与载体质粒pPICZα-A重组，克隆于大肠杆菌TOP10，以Zerocin抗性基因筛选得含重组质粒pACAD5的转化子；用锂盐法将重组质粒pACAD5转入毕赤酵母中表达，获得抗菌肽CAD毕赤酵母工程菌GSCAD5；将含抗菌肽CAD的毕赤酵母GSCAD5菌株在培养基中摇瓶培养2作为菌种：将菌种接入盛有培养基的发酵罐中发酵培养，培养24小时后，取样检测菌体密度达6OD以上时加入95％甲醇，甲醇加入量1％(占发酵液总量)诱导产生抗菌肽，继续培养72小时后，抽样检测菌体密度达10OD以上后，通入100℃蒸汽，20-30分钟，放料，发酵液离心，除去菌体，滤液浓缩到原体积的1/10，将浓缩液冻成干粉，即为抗菌肽毕赤酵母制品。3