抗菌肽啤酒酵母的制备与应用
柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌作用。根据天然抗菌肽A的1－11位氨基酸序列及抗菌肽D的12－37位氨基酸序列，设计抗菌肽AD基因，克隆于啤酒酵母中表达。经优化培养基配方和培养条件，在发酵罐中达到高密度培养及高效表达(5000单位／毫升)。将抗菌肽酵母制品按5000单位／Kg添加于仔猪饲料中，或以60－100单位／日·头添加于雏鸡饮水中，能预防与治疗禽畜腹泻，可代替部分抗生素作为饲料添加剂。
发明专利
CN01107585.6
2001-02-28
CN1308124
2001-08-15
C12N1/19
华南农业大学
黄自然;黄亚东;郑青;姚汝华
510642广东省广州市天河区五山
华南理工大学专利事务所
伍宏达
广东;44
权利要求书1．抗菌肽啤酒酵母的制备，其特征在于根据柞蚕天然抗菌肽基因设计抗菌肽AD氨基酸序列及其基因BamHI M K W K L F K K I E K V G5′GGATCCGT ATG AAA TGG AAG TTG TTC AAA AAG ATT GAA AAG GTT GGT3′CCTAGGCA TAC TTT ACC TTC AAC AAG TTT TTC TAA CTT TTC CAA CCAF1Q R V R D A V I S A G P A V ACAA AGA GTT AGA GAC GCT GTC ATC TCT GCT GGT CCT GCT GTT GCCCTT TCT CAA TCT CTG CGA CAG TAG AGA CGA CCA GGA CGA CAA CGGF2T V A Q A T A L A KACT GTT GCT CAA GCT ACT GCC TTG GCT AAG TAATAAGAATTCGTCGAC 3′TGA CAA CGA GTT CGA TGA CGG AAC CGA TTC ATTATTCTTAAGCAGCTG 5′EcoRI SalI用DNA合成仪合成含82个碱基的F1多聚脱氧核糖核苷酸片段和含78个碱基F2多聚脱氧核糖核苷酸片段，它们之间有20个碱基互补；设计合成引物1：5′GGATCCGTATGAAATGGAAG 3′引物2：3′TCATTATTCTTAAGCAGGCTG 5′通过F1、F2和引物1、2，用PCR(聚合酶链反应)方法合成具有134个碱基对的抗菌肽AD基因；将抗菌肽AD基因与pCRTM2.1质粒(T载体)用T4DNA连接酶连接构建成pCRCAD重组质粒；用pCRCAD重组质粒转化大肠杆菌JM109，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和溴氯吲哚半乳糖苷(X-gal)筛选获得含重组质粒1pCRCAD的转化子；用限制性核酸内切酶BamHI和SalI酶切得到抗菌肽AD基因(cecropin ADgene)片段，该基因片段具有134碱基(bp)；将抗菌肽AD基因片段与穿梭质粒pCLWA2用T4DNA连接酶连接构建成含抗菌肽AD基因的重组表达质粒pCAD；用锂盐法将重组表达质粒转化于亮氨酸缺陷型啤酒酵母AB103；用缺亮氨酸培养基筛选抗菌肽AD酵母工程菌株；将抗菌肽AD酵母工程菌株在培养基培养得到抗菌肽AD酵母制品。2