用DNA指纹判别家蚕杂交率的鉴定方法
用DNA指纹判别家蚕杂交率的鉴定方法，是以蚕卵或蚁蚕为材料，以每一品种的亲本和杂交种为一个组合，分别快速提取DNA模板，与适当的DNA合成引物构成反应体系，扩增特异性的DNA片断，建立每一品种的亲本和杂交种的特征性DNA片段电泳参照图谱，作为杂交率鉴别的依据。再抽取100～1000粒的蚕卵或蚁蚕构成样本，用上述方法建立每一个体的DNA片段电泳图谱，并与参照图谱比较，判断是否是杂交种子，算出样本的杂交率。用数理统计的原理算出由样本杂交率推断总体杂交率的正确性，并设定其为95～99％。
发明专利
CN01103272.3
2001-01-19
CN1311337
2001-09-05
C12Q1/68
浙江大学%浙江省湖州蚕桑科学研究所
钟伯雄;丁农
310027浙江省杭州市玉古路20号
浙江大学专利代理事务所
林怀禹
浙江;33
权利要求书1．用DNA指纹判别家蚕杂交率的鉴定方法，其特征在于它的方法是：(1)DNA模板的提取第一步：取1粒蚕卵或1条蚁蚕，加入10～100μl 0.1～1.0mol/L NaOH,0.5～2.5％ME缓冲液，冰浴研磨10～30min，加50～200μl 50～200mmol/LTris-HCl pH6～9缓冲液，搅拌10min,10000～15000×g、4℃离心5～20min；第二步：取上清液10～100μl，加2.5倍99％酒精，-20℃中放置15～60min,10000～15000×g、4℃离心5～30min，用10～100μl无菌去离子水溶解，即得到PCR反应所需的DNA模板；(2)PCR反应的引物如下随机引物，可在目前生产用蚕品种的亲本与杂交种之间形成特征性的谱带，用于杂交率的鉴定┏━━━━━┳━━━━━━━┓┃引物名 ┃引物序列 ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ZHD0001 ┃ CGGCACTGAGGA ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0002 ┃ CAGGTCTTGGG ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0003 ┃ GGGCACTGAGGT ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0004 ┃ TGGATGAGACC ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0005 ┃ TGTAACCAGCC ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0006 ┃ GTGGCGTCCTT ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0007 ┃ TGGCACTGAGGA ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0008 ┃ GTGCCCAGCCT ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0009 ┃ GATCTGACTGT ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0010 ┃ GGGCACTGAGGA ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0011 ┃ AGGCACTGAGGG ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0012 ┃ CGGCACTGAGGG ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0013 ┃ AGTGCCTAACC ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0014 ┃ TGGCACTGAGGT ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0015 ┃ AAGGTCTTGGG ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0016 ┃ GGGCACTGAGGC ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0017 ┃ GAAAGTGCGGC ┃┣━━━━━╋━━━━━━━┫┃ ZHD0018 ┃ AGGAGGAGAGG ┃┗━━━━━┻━━━━━━━┛1┏━━━━━┳━━━━━━━━┓┃ ZHD0019 ┃ CGGCACTGAGGC ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0020 ┃ TAGGTCTTGGG ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0021 ┃ TGGCACTGAGGG ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0022 ┃ CGAAGCCAGCC ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0023 ┃ AGGCACTGAGGC ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0024 ┃ ACAGTGCCGGT ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0025 ┃ GGGCACTGAGGG ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0026 ┃ CGGCACTGAGGT ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0027 ┃ GACGTAGCGTC ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0028 ┃ TGGCACTGAGGC ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0029 ┃ GCAGCACTGAC ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0030 ┃ ACAGTGCTGTG ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0031 ┃ AGGTCTTGGGT ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0032 ┃ AGGCACTGAGGA ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0033 ┃ TGTCAGGGCAA ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0034 ┃ GTGGAGAGCAG ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0035 ┃ ATAGACTGACATCA ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0036 ┃ AGGCACTGAGGT ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0037 ┃ CACCACTCCGA ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━┫┃ ZHD0038 ┃ GAGGTCTTGGG ┃┗━━━━━┻━━━━━━━━┛(3)PCR反应条件PCR反应体系：上述抽提得到的DNA模板液1～5μl；Taq DNA聚合酶0.2～5u；按总体积1/l0的量加入10倍PCR反应缓冲液，组成成分：100mM/L Tris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20mM/L MgCl2,0.5％NP-40 pH9.0；dNTP各0.15～0.25mmol/L；加上述DNA合成引物，使终浓度为0.1～1.5μmol/L；加无菌去离子水，使总体积达到10～100μl；PCR反应条件：94～95℃预热4～5min；2变性解链：94℃ 0.5～2min；复性：30～50℃ 0.5～2min；合成延伸：70～75℃ 1～5min；循环：30～45次；保存：70～75℃，5～10min；4℃,0.5～12h；反应设备：PCR反应仪；(4)DNA电泳采用0.8～1.5％琼脂糖凝胶，电泳缓冲液用0.5～1％TAE或TBE；(5)样本容量取100～1000粒蚕卵或蚁蚕作为样本，供杂交率鉴定用，用样本的结果推断总体的结果，正确率可达到95～99％。3