建立ApoAI细胞靶标筛药系统及筛选升HDL药的方法
本发明公开了建立ApoAI细胞靶标筛药系统及筛选升HDL药的方法。本发明建立的ApoAI细胞靶标是运用分子克隆技术，将控制动脉粥样硬化关键蛋白ApoAI的Promoter基因部分克隆进肝细胞株，获得在基因水平上表达的筛药细胞靶标。通过测定被筛选化合物激发ApoAI Promoter的程度来筛选抗动脉粥样硬化升HDL药。
发明专利
CN00125733.1
2000-10-20
CN1350061
2002-05-22
C12Q1/68
上海医药(集团）总公司
龚邦强;陆浩钧
200020上海市太仓路200号
上海新天专利代理有限公司
王巍
上海;31
权利要求书1、一种建立ApoAI细胞靶标筛药系统的技术分案，其特征在于：I人基因组DNA的提取1)取抗凝血2ml，用2倍的生理盐水稀释混匀，2)在离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，在液面上轻轻加入4ml已稀释混匀的血液，室温下离心200g 20分钟，(注：此时红细胞沉于管底，白色的淋巴细胞及其它有核细胞分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面)，3)吸弃上清，小心吸出中间有核细胞层，转入1.5ml Eppendorf管中，用生理盐水洗涤1次，4)将细胞悬浮于TE缓冲液中，加SDS至终浓度为0.5％，蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，50℃水浴3小时，其间振摇2-3次，5)加入等体积平衡酚混匀，室温离心，10000g离心5分钟，6)小心吸取上清，并转移至另一Eppendorf管，勿将蛋白层吸出，7)加入等体积氯仿：异戊醇(24∶1)，混匀，离心10000g，5分钟，8)转移上清至另一Eppendorf管中，加入1/10体积乙酸钠(PH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-80℃放置30分钟，9)离心12000g，15分钟，弃上清，加1ml冷75％乙醇轻洗管壁，10000g5分钟，弃尽上清，37℃静置干燥10分钟，10)用100μlTE(pH8.0)溶解Genomic DNA；II以人基因组DNA为模板用PCR技术复制获取Apo AI Promoter DNA序列引物：上游：5’ GACTCGAGAGGGGAAGGGGATGAGTG 3’下游：5’ ATAGATCTCCTGAACCTTGAGCTGGG 3’上下游引物各 1μl 浓度为10μmol/L10×PCR反应缓冲液 5μldNTP(2mmol/L) 5μl 浓度为200μmol/LGenomicDNA模板 1μl 总量1μg去离子水 补至50μl混匀后离心15S，加石蜡油30μl于反应表面，97℃变性10分钟，冰浴冷却，加Taq酶(5U/μl)1μl，短暂离心，开始循环：变性：95℃ 30s退火：60℃ 45s延伸：72℃ 90s重复30循环，1