运用基因整合平台系统进行蓝藻转基因及表达胸腺素α1的方法

摘要：

涉及一种基因工程，从蓝藻Calothrix７６０１染色体ＤＮＡ上ＰＣＲ扩增出cpc2启动区、整合平台同源片段Ｌ和Ｒ，组装了含cpc2启动区、ＵＢＴα_１目的基因、rbcS终止子、Km^r报告基因和基因整合平台同源序列等元件的供体质粒pUTK，建立了Calothrix７６０１新的基因整合平台系统，获得转ＵＢＴα_１基因的藻株，并从中检测到Ｔα_１基因的表达产物。本发明以蓝藻作为新型基因工程受体和生物反应器，使人的Ｔα_１基因在其中高效表达，以大量生产Ｔα_１，具有很大的开发前景。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN00124700.X

申请日期：2000-09-29

公开/公告号：CN1285408

公开/公告日：2001-02-28

主分类号：C12N15/63

申请/专利权人:厦门大学

发明/设计人:章军;楼士林;徐虹;罗田

主申请人地址:361005福建省厦门市思明南路422号

专利代理机构:厦门大学专利事务所

代理人:陈永秀%马应森

国别省市代码:福建;35

权利要求：

权利要求书1．运用基因整合平台系统进行蓝藻转基因及表达胸腺素α1的方法，其特征在于按设计从蓝藻Calothrix 7601染色体DNA上PCR扩增出藻蓝蛋白cpc2启动区、整合平台同源片段L和R，组装了含cpc2启动子、UBTα1目的基因、rbcS终止子、Kmr报告基因和基因平台同源序列等元件的供体质粒pUTK，建立了Calothrix 7601新的基因整合平台系统，获得了转UBTα1基因的藻株，其具体方法步骤如下：(1)cpc2启动区(P)和同源DNA片段(L和R)的克隆根据丝状蓝藻Calothrix 7601的cpc2操纵子的启动区P以及同源片段L和R这三个片段两端的核苷酸序列分别设计三对PCR引物P1和P2，L1和L2，R1和R2，其序列如下：其中启动区左端引物P2设计了一个SphI酶切位点，其序列为GCATG↓C，以Calothrix7601的染色体DNA为模板，按常规的PCR技术分别扩增出0．6kb片段P，1．2kb片段L和1．2kb片段R；根据引物中的酶切位点，用SphI和SalI同时双酶切片段P和载体pUC19，然后用T4DNA连接酶连接，连接物转化受体菌E．coli JM101，用蓝白筛选得到白色克隆子，得重组质粒pUCP；用HindIII和SalI同时双酶切片段R和载体pUC19，然后用T4DNA连接酶连接，连接物转化受体菌E．coli JM101，用蓝白筛选得到白色克隆子，得重组质粒pUCR；用EcoRI和SalI双酶切片段L和重组质粒pUCP后，用T4DNA连接酶连接，连接物转化受体菌E．coli JM101，用蓝白筛选得到白色克隆子，得重组质粒pULP；(2)外源供体片段DNA的克隆：a．卡那霉素-Kmr报告基因和rbcS polyA终止区的克隆：选择含有报告基因卡那霉素-Kmr和终止区rbcS polyA两个片段的质粒pKYLX71，用XbaI和SalI双酶切pKYLX71，胶回收4．8Kb的DNA片段，与经同样双酶切的重组质粒pUCR连接，连接物转化E．coli JM101，以含有Ap和Km的双抗培养基筛选，获得了8．7kb的重组质粒pUKR；1b．目的基因UBTα1的获得及克隆：按Tα1基因的序列设计了以下PCR引物T1、T2和T2’：T2’(3’端引物)：为T2之5’端的前25个核苷酸以T1和T2为引物，按常规PCR扩增得Tα1片段，以质粒pUCUB为模板，引物为U1和U2，PCR扩增出UB片段，用BamHI酶切Tα1和UB片段后连接，再以此连接物为模板，以U1和T2’为引物扩增获得UBTα1片段。用Xba I和HindIII不完全酶切pUKR，回收6．0Kb片段，用Sph I和Spe I双酶切目的基因UBTα1；用Sph I和HindIII双酶切pULP，将以上三种酶切片段混合后连接，转化，以Ap和Km双抗筛选，获得了供体质粒pUTK；(3)供体质粒pUTK电激转化Calothrix 7601用EcoRI完全酶切pUTK，获得线状质粒pUTK，在电压0．4～2．0kv，电阻100～200Ω，时间2．5～5．0ms、电容25μF的条件下电激转化蓝藻Calothrix 7601，将经电激处理后的转化藻株经培养，以Km筛选，获得转UBTα1基因的藻株。2