重组枯激酶的生产方法及其生物活性

摘要：

重组枯激酶的生产方法及其生物活性，本发明属于生物工程技术，其主要解决自然菌产生枯激酶量少、发酵时间长，难以用于生产等问题。在自行筛选的Batillus Subtilis发酵产生枯激酶的基础，克隆出该酶基因，建立了一整套基因工程菌发酵，诱导表达，包涵体分离，洗涤，裂解，变性，复性和蛋白质纯化工艺，获得重组枯激酶纯品，其体外具有溶解纤维蛋白和凝结血块能力，体内有促进内皮细胞产生t－PA缩短优球蛋白溶解时间，及强的纤溶酶样活性。表明重组枯激酶可能作为新一代基因工程溶栓药物。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN00116055.9

申请日期：2000-09-29

公开/公告号：CN1306086

公开/公告日：2001-08-01

主分类号：C12N9/00

申请/专利权人:武汉迪普生物技术有限公司

发明/设计人:王春生;杨志兴;吴晶;林元通;程汉强;许文娟

主申请人地址:430072湖北省武汉市武昌区广八路19号空疗1号楼

专利代理机构:武汉市专利事务所

代理人:王和平

国别省市代码:湖北;42

权利要求：

1．一种重组枯激酶的生产方法包括：工程菌种的发酵，饱和硫酸铵沉淀目的蛋白，目的蛋白硫酸铵沉淀物的透析，用DEAE-纤维素DE-52柱层析分离目的蛋白，用CM-纤维素CM-52进一步纯化目的的蛋白。用PEG-10000浓缩目的蛋白，Sephadex G-100柱层析纯化目的蛋白等步骤，其特征在于工程菌种及发酵，从4℃保存的菌种平皿中，挑取单菌落接种在5mlLB培养液试管中，含Amp抗菌素100μg/ml,30℃培养，180转/分钟，振荡培养18小时。按1∶50接种在200mlLB培养液/1000ml三角瓶中，氨苄为100μg/ml。30℃,150转/分钟，培养24小时后，离心，6000转/分钟，20分钟，收集上清液，电泳检测目的蛋白在发酵液中的含量。