靶向导人人肝细胞的高效基因工程药物的生产方法
靶向导入人肝细胞的高效基因工程药物的生产方法，其将目的基因插入克隆的人乙肝病毒基因组的多聚酶基因开放读码框架tether区，构成重组乙肝的病毒基因单体，再通过生物学常规技术，使该重组基因单体两端为限制性内切酶识别位点；单体头尾串联后，克隆到病毒基因表达载体质粒中，并转染到人肝癌细胞系HepG2细胞后，从上清液中收获含有目的基因的完整的重组人乙肝病毒颗粒。利用本发明生产的靶向导入人肝细胞的高效基因工程药物，具有对人肝细胞的嗜性和在人肝细胞内复制的能力，低剂量就可以进行靶向基因治疗肝脏疾病，安全高效。
发明专利
CN00113313.6
2000-03-09
CN1313385
2001-09-19
C12N15/09
李玉波
李玉波
421001湖南省衡阳市医学院路1号
湖南省衡阳市专利事务所
吕伴
湖南;43
权利要求书1、靶向导入人肝细胞的高效基因工程药物的生产方法，其特征是将目的基因插入到已经克隆的人乙型肝炎病毒基因组的多聚酶(pol)基因开放读码框架的tether区，构成重组乙型肝炎的病毒基因单体，再通过分子生物学常规技术，使该重组基因单体两端为限制性内切酶ECORⅠ识别位点(ECORⅠ-ECORⅠ)，最后，将两个ECORⅠ-ECORⅠ单体头尾串联后，克隆到病毒基因表达载体质粒中，并转染到人肝癌细胞系HepG2细胞后，从细胞培养上清液中，就可以大量收获到基因组中含有目的基因的完整的重组人乙型肝炎病毒颗粒，其具体步骤是：(1)克隆人乙型炎病毒全基因a、从乙型肝炎病毒阳性血清中提纯乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)b、以HBVDNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)技术特异扩增乙型肝炎病毒全基因；c、用合适的限制性内切酶和DNA连接酶，将乙型肝炎病毒全基因插入质粒载体；d、转化工程菌大肠杆菌，培养后选取阳性克隆。(2)、特异扩增用于基因治疗的目的基因，如肿瘤抑制基因P16基因、凝血因子Ⅷ基因、凝血因子Ⅸ基因、低密度脂蛋白(LDL)受体基因等。a、从人组织细胞中提纯总RNA(总核糖核酸)，以此为模板逆转承合成CDNA(互补脱氧核糖核酸)；b、以CDNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)技术特异扩增目的基因，并使其两端带上限制性内切酶BstEⅡ的识别位点，以便于将目的基因插入乙型肝炎病毒(HBV)基因中；(3)、基因重组乙型肝炎病毒(HBV)基因和目的基因a、用限制性内切酶BstEⅡ分别消化，切化HBV基因和目的基因；b、用DNA连接酶，使目的基因插入到HBV基因组中的多聚酶(pol)基因开放读码框架的tether区的BstEⅡ位点中，位于前外膜蛋白(S蛋白)基因(pres1)启动子下游，构成重组HBV基因单体；1c、再用限制性内切酶ECORⅠ和DNA连接酶，使带有目的基因的重组HBⅤ基因单体两端为限制性切酶ECORI识别位点(ECORⅠ-ECOR])，并且将两个(ECORⅠ-ECORⅠ)单体头尾串联；(4)、重组人乙型肝炎病毒的表达，纯化a、用限制性内切酶ECORI和DNA连接酶，使ECORⅠ-ECORⅠ串联体插入到真核细胞表达质粒载体DT7-1的ECORⅠ位点，构建重组乙型肝炎病毒表达质粒；b、将该表达质粒转化工程菌大肠杆菌EL21(DE3)中，培养后选取阳性克隆并提纯；c、纯化的表达质粒转染人肝癌细胞系HepG2细胞；d、从细胞培养液中，提纯基因组中含有目的基因的完整的重组人乙型肝炎病毒颗粒；f、真空冷冻干燥，得靶向导入人肝细胞的高效基因工程药物，置2-8℃贮藏备用。2