端粒酶活性的定量测定方法
一种端粒酶活性的定量测定方法,包括含端粒酶的S-100细胞抽提液的制备;端粒酶介导的引物延伸反应;PCR扩增反应产物以及通过DNA荧光染料染色来进行的结果分析。本发明还具有下列优点:无放射性玷污,端粒酶的定量测定的步骤更简化,实验周期更短,重复性更好。在灵敏性方面和在避免Taq DNA聚合酶抑制剂所引起的假阴性及引物二聚体引起的假阳性方面同Kim放射性定量法相比也相当。
发明专利
CN00111629.0
2000-01-28
CN1319675
2001-10-31
C12Q1/25
中国科学院上海细胞生物学研究所
张如刚;谢弘;来文;王放;陈中建
200031上海市岳阳路320号
上海华东专利事务所
费开逵
上海;31
权利要求书1.一种端粒酶活性的定量测定方法,包括下列步骤:含端粒酶的S-100细胞抽提液的制备;端粒酶介导的端粒重复序列的延伸;PCR扩增端粒酶作用产物;扩增结果的分析和利用计算公式进行定量分析,其特征在于在含端粒酶的S-100细胞抽提液的制备步骤中,直接取待抽提细胞用磷酸盐缓冲液洗一次;在端粒酶介导的端粒重复序列的延伸步骤中,在TRAP缓冲液中加入无放射性的TS[5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’]引物;在扩增结果的分析步骤中,电泳结果采用荧光染料染色;在利用计算公式进行定量分析步骤中,利用公式TPG={[(TP-B)/TI]/[(R8-B)/RI])其中:TP为待定量的细胞提取液所得条带灰度TI为待定量的细胞提取液的内部参照所得条带灰度R8为定量参照所得条带灰度(反应体系中的量为0.1amol时为标准)B为只加裂解液所得条带灰度RI为R8的内部参照所得的条带灰度