一种栝楼毛状根诱导和培养生产核酸抑制蛋白的方法

摘要：

本发明涉及一种栝楼毛状根诱导和培养生产核酸抑制蛋白的方法，首先在植物培养基上加入蔗糖和琼脂制成培养基，将栝楼种子接种在培养基上，将发根农杆菌接种在培养基上，使细菌活化，将栝楼种子的无菌植株作成外殖体，接种针刺伤沾菌的节位处，从节位处形成不定根，将其接种在营养液中得到毛状根，经纯化处理即获得核酸抑制蛋白。本发明的方法培养毛状根，其产量可以达到２００—３００ｇ／Ｌ／２０日，其中核酸抑制蛋白含量达到０．５—１．０‰。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN00109602.8

申请日期：2000-06-16

公开/公告号：CN1280191

公开/公告日：2001-01-17

主分类号：C12P21/00

申请/专利权人:清华大学

发明/设计人:郭志刚

主申请人地址:100084北京市海淀区清华园

专利代理机构:清华大学专利事务所

代理人:罗文群

国别省市代码:北京;11

权利要求：

权利要求书1、一种栝楼毛状根诱导和培养生产核酸抑制蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下各步骤：(1)在每升植物培养基上加入20g／l蔗糖和8g／l琼脂，在125℃，0．1mPa压力下消毒15—18分钟，经冷却后作成平板培养基；将栝楼种子用乙醇和次氯酸钠消毒后，接种在第1步的培养基上，于20—25℃，用日光灯照射，亮度为1000—3000lx，每日光照12—16小时培养20—30天，种子萌芽长成无菌植株备用；(2)在每升细菌培养基上加入10g／l琼脂，经125℃，0．1mPa压力下消毒15—18分钟，经冷却后作成斜面培养基；(3)将发根农杆菌LBA9402菌接种在第3步的培养基上，在35—37℃，避光条件下培养3天，将细菌活化；(4)将第2步培养出的无菌植株，从每个节间留下2枚叶片剪断，作成外殖体，并且在节位处涂上LBA9402细菌，用接种针刺伤沾菌的节位处，然后接种在第1步的培养基上，在20—25℃，日光灯下，强度为500—1000lx，培养10—30天，从被刺伤的节位处形成不定根；(5)在每升植物培养基上加入蔗糖20g／l和氨卞青霉素30—150mg／l制成杀菌培养基，将第5步形成的不定根剪下，放在杀菌培养基内，培养3—10天，更换同样的杀菌培养基内反复除菌培养2—5次，彻底除掉细菌后，转接在第1步的培养基内筛选生长速度最快的根系；(6)在每升植物培养基中加入20g／l蔗糖，制成培养液，加入筛选出的毛状根，在20—25℃，日光灯照射，光强为500—1500lx，在转速为90—150rmp的摇床上，培养15—25天，获得50—100倍重量的毛状根；(7)在生物反应器内，加入第1步的培养液，再添加维生素、氨基酸、诱导子，经高温灭菌处理后，按照培养液重量的2—10％接种上第8步的毛状根，在20—25℃，弱光或黑暗条件下培养15—30天，就会获得50—100倍重量的毛状根；(8)将毛状根经冷冻后进行破碎处理，然后在4℃低温下提取和分离蛋白质，经过纯化处理即获得本发明的26kd、27kd和29kd的核酸抑制蛋白。