重组人硒蛋白P基因表达纯化方法及专用引物与培养基

摘要：

本发明涉及一种重组人硒蛋白P基因的表达纯化方法与专用引物及专用培养基，该方法将人肝细胞cDNA，用PCR方法(引物1为5′GTGGTTGTGACAACCCCAGC3引物2为5′AATGGAAAGCATGTCTTTGT)获得人硒蛋白P基因，并将该基因重组后克隆到大肠杆菌表达载体中，在有1－20ng/ml亚硒酸钠及富硒酵母提取物的培养基中进行培养表达，表达产物用金属螯合镍亲和层析纯化，本发明的方法为大量生产人硒蛋白P奠定了基础。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN00103136.8

申请日期：2000-03-20

公开/公告号：CN1314469

公开/公告日：2001-09-26

主分类号：C12N15/12

申请/专利权人:北京市营养源研究所

发明/设计人:杨建国

主申请人地址:100054北京市右安门外东滨河路甲2号北京市营养源研究所

专利代理机构:北京市专利事务所

代理人:郭佩兰

国别省市代码:北京;11

权利要求：

权利要求书1、一种表达纯化重组人硒蛋白P基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)、克隆人硒蛋白P的基因，用反转录PCR法扩增硒蛋白P的基因；(2)、将上述扩增的硒蛋白P基因与克隆载体连接，构建人硒蛋白P克隆质粒；(3)、将上述人硒蛋白P克隆质粒亚克隆进表达载体，再将连接后的质粒DNA转染大肠杆菌；(4)、表达全长人硒蛋白Pa、将上述带有人硒蛋白P基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；b、从板上选一个菌落，放入装LB培养基培养瓶内，在30℃摇箱内培养，测菌液A650 OD值为0.5时停止培养；c、将上述菌液放入装有富硒培养基的培养瓶内，在37℃摇箱内培养5小时，测菌液A650 OD值，当OD值为1.0时，向菌液内加IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖苷)，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；d、收获细菌；(5)、纯化人硒蛋白Pa、将上述细菌沉淀用pH 8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；b、裂解细菌，离心取上清液；c、初步纯化人硒蛋白P；d、用金属镍螯合剂亲和层析进行纯化。