用磁稳定流化床培养贴壁依赖性动物细胞生产病毒的方法
本发明涉及一种用磁稳定流化床培养贴壁依赖性动物细胞生产病毒的方法。将培养系统和经预处理的微载体清洗、灭菌后，注入细胞培养基浸泡微载体适当时间；接种，让细胞在微载体上贴壁，让培养基循环、充氧，废弃部分培养基同时补充新鲜培养基，进行细胞培养过程。更换病毒培养基，接入种毒；让病毒在细胞上吸附完全；让培养基循环，适时将磁稳定流化床培养基出口流出的液体切换至收获液出口至收获液储罐，连续或分批收获病毒。用本发明培养Vero细胞生产乙脑病毒，细胞密度达到10<sup>8</sup>个细胞／ml以上，病毒滴度达到8．5TCID<sub>50</sub>。
发明专利
CN00100230.9
2000-01-10
CN1303924
2001-07-18
C12N5/16
中国科学院化工冶金研究所
丛威;吕秀菊;高红亮;欧阳藩
100080北京市海淀区中关村北二条一号
上海华东专利事务所
李柏
北京;11
1．一种用磁稳定流化床培养贴壁依赖性动物细胞生产病毒的方法，其特征在于该方法的步骤为：(1)在磁场关闭的状态下，清洗磁稳定流化床动物细胞和病毒培养系统内的所有容器、管路；在启动磁稳定流化床动物细胞和病毒培养系统的控制装置之前设定细胞培养所需的溶液pH值范围、溶解氧范围及反应温度；(2)将磁敏性微载体预处理后由微载体加入口加入到磁稳定流化床中，然后由灭菌蒸汽入口向系统内通入蒸汽灭菌；或在通入蒸汽前加入缓冲液至浸没磁敏性微载体再通入蒸汽灭菌，所述的缓冲液为磷酸缓冲液；或将磁敏性微载体单独灭菌后在无菌环境下加入到已经灭菌的磁稳定流化床中；其中磁敏性微载体的加入量按视体积计为磁稳定流化床工作体积的10％～95％，磁敏性微载体的矫顽力低于200安培/米，粒径为50μm～2mm，湿比重为1.1～2.5g/cm<superscript>3</superscript>，磁稳定流化床的液体表观流速为5厘米/分钟～25厘米/分钟，磁场强度为3～100mT；(3)冷却后将磁稳定流化床内的液体由排水口排出；经过微孔滤膜由磁稳定流化床培养基入口向磁稳定流化床内注入细胞培养基至浸没磁敏性微载体但不超过磁稳定流化床的工作体积的95％，浸泡磁敏性微载体适当时间；(4)由磁稳定流化床的接种口加入已制备好的细胞种子液；(5)经过气体过滤装置由磁稳定流化床的灭菌蒸汽入口通入能使磁敏性微载体悬浮的无菌空气或富氧空气，持续5秒钟以上，使磁敏性微载体颗粒悬浮并与液体充分混合，然后开启磁场，停止通气，20-30分钟后关闭磁场——通气——开启磁场——停止通气；以后每隔20-30分钟重复关闭磁场——通气——开启磁场——停止通气的过程，直至细胞在磁敏性微载体上贴壁完全；其中的通气是指前述的经过气体过滤装置通入能使磁敏性微载体悬浮的无菌空气或富氧空气并持续5秒钟以上；经过微孔滤膜补足细胞培养基使之充满充氧装置和管路；(6)启动磁稳定流化床动物细胞和病毒培养系统的控制装置和充氧装置，让细胞培养基循环，进行细胞培养过程；根据实际操作的需要，经过微孔滤膜连续或分批补充新鲜细胞培养基，定时取样分析，直至达到所需的细胞密度或预定的培养时间；关闭磁稳定流化床动物细胞和病毒培养系统的控制装置和充氧装置，停止细胞培养基的循环；在细胞培养过程中，每隔2-12小时将磁场关闭一下，再重新开启；(7)将磁稳定流化床培养系统中的细胞培养基排出，经过微孔滤膜由培养基入口加入洗涤液至充满培养系统，用洗涤液浸泡培养系统或使洗涤液在培养系统中循环一定时间，对磁稳定流化床动物细胞和病毒培养系统进行洗涤，然后排出洗涤液；设定病毒培<!-- 1 -->