从四川地区发病仔猪分离到3株病毒(SC1、SC2和SC3),电镜下可见病毒呈球形,有囊膜,病毒能在Marc-145细胞上生长并致细胞出现CPE,直径约55nm,核酸为RNA,不凝集猪、黄牛、犬、兔、豚鼠、鸡、鸭、鹅的红细胞;pH值2,3,4,8,9,10处理30 min和56℃处理60 min病毒即失去对Marc-145细胞的感染能力.经病毒中和实验、特异性单克隆免疫荧光抗体和特异性RT-PCR鉴定表明分离毒为美洲型猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV),分离病毒素回归30日龄仔猪可出现高热和呼吸道症状.研究首次从病原学角度证实美洲型PRRSV在四川的存在,利用分离毒制备的疫苗具有良好的免疫原性.

病毒与宿主间的相互作用位点为病毒感染细胞提供可能性, 位于宿主细胞上的结合位点称作受体.目前在宿主细胞的免疫球蛋白超家族、低密度脂蛋白受体家族、补体家族和整联蛋白细胞粘附分子家族等中陆续发现了小RNA病毒的受体.了解各个受体的利用情况, 对理解病毒感染机制、宿主嗜性和抗病毒机理有重要意义.本文主要就已证实的小RNA病毒受体进行分类概述, 以期为深入研究小RNA病毒的致病机理及其防控提供参考.

参照Genebank大肠埃希氏菌属(E.coli)16SrDNA保守基因序列设计并合成定量PCR引物及针对大肠杆菌属的Taqman探针,以E.coli标准菌株的PCR扩增产物作为阳性模板制作标准曲线,建立检测E.coli的定量PCR方法.该法Mg2+最佳工作浓度5 mmol/L,能够定量和特异检测E.coli而对肠道优势菌群的代表种葡萄球菌、双歧杆菌呈阴性.检测E.coli厅的灵敏度可达3个/mL.利用该法对DPV强毒感染鸭急性病例的气管和消化道E.coli检测,结果表明:气管E.coli数量普遍低于对照.食道波动巨大,普遍高于对照;十二指肠、空肠变化不明显;回肠波动巨大,总体高于对照;盲肠显著低于对照;直肠与对照差异不显著.DPV感染致死鸭的气管E.coli数量显著低于对照;食道和十二指肠极显著高于对照;空肠、回肠和盲肠均略高于对照;直肠略低于对照.

为了确定重组鸭α-干扰素(DuIFN-α)基因工程菌BL21(DE3)/pET32a+-DuIFN-α的最佳表达条件,对影响原核表达的主要因素:IPTG浓度、诱导时期、收获时间、培养诱导温度、葡萄糖浓度及培养基进行了优化;并利用抗性筛选对表达质粒的稳定性进行了研究.结果显示,诱导基因工程菌BL21(DE3)/pET32a+-DuIFN-α表达DuIFN-α的最佳条件为:以TB+5 g/L葡萄糖培养基37 ℃培养至菌体OD600=0.8～1.1时,加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L,30 ℃诱导培养4～5 h.在最佳表达条件下,DuIFN-α的相对含量为34.1%,总含量(终菌体浓度×相对含量)达79.9;各种优化条件对表达质粒的稳定性未见明显影响.

用限制性核酸内切酶Sall酶切已缺失gⅠ(gE)和部分gp63(gⅠ)的重组质粒PPB7-1DNA后,回收大小约6.0kb片段,经T4DNA连接酶连接后转化入大肠杆菌DH5α株,得到含gp63片段的转移载体质粒PP63.再以SV40早期启动子控制的大肠杆菌β-半乳糖苷酶(LacZ)基因作为报告基因,将其插入PP63中gp63基因起始密码子ATG下游的StuⅠ位点,在选择培养基中筛选出表达β-半乳糖苷酶的转化子,构建了以gp63为同源序列含LacZ报告基因的转移载体质粒,命名为PP63LacZ.在该转移载体质粒中,LacZ基因的两端分别与0.3kb和0.5kb的PRV gp63同源序列相连,经酶切、核酸分子杂交技术鉴定,结果表明该转移载体质粒的构建是成功的.

参照已克隆的天府肉鹅IFN-α完整ORF基因序列设计引物,克隆成熟肽基因,与载体pET32a连接,构建原核表达载体,并在表达菌Rosetta中表达,SDS-PAGE分析鉴定,通过Ni-IMAC亲和层析纯化和稀释透析复性后,采用微量细胞病变抑制法分析测定IFN的抗病毒活性.结果显示,IFN-α成熟肽基因全长486 bp,共编码161个氨基酸；成功构建了原核表达载体pET32a-mGoIFN-α并得到表达,SDS-PAGE和Western-blot分析表达蛋白的大小为38 ku；纯化复性后的表达蛋白抗水泡性口炎病毒(VSV)活性的比活力为5.52×103U/mg,表明重组蛋白具有良好的抗病毒活性.

探讨免疫组化(IHC)和原位杂交(ISH)方法检测石蜡切片中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的特异性和敏感性,为PRRSV在猪体内的定位、致病机理研究等提供有效的试验手段.用免疫组化、原位杂交的方法检测人工感染PRRSV猪的组织,结果在人工感染后7d,用免疫组化在肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、肠检测到阳性信号；用原位杂交在肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、十二指肠、大脑检测到阳性信号,两组结果差异不大；但在感染后35d,用免疫组化检测只有肺门淋巴结为阳性,而原位杂交检测显示肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、十二指肠、大脑仍为阳性.

提取鸭病毒性肠炎病毒(DEV)基因组DNA,超声波处理使其片段化,经补平末端后,分级分离并收集各部分DNA片段,与质粒pBluescript Ⅱ SK(+)连接,转化大肠杆菌DH5α,成功构建了DEV基因文库.随机选取文库中的重组质粒测序分析,DNA序列拼接后获得大于100bp以上ORF共187个,将其中一个含完整ORF的DNA片段,以BLASTX软件与Genbank上相应基因进行比对分析,初步确定为一种核衣壳蛋白基因.根据该基因片段序列,设计引物对DEV DNA进行PCR扩增,并克隆到pGEM-T载体上,转化宿主菌JM109,提取阳性重组质粒,经PCR检测、酶切鉴定、测序和生物信息学分析,确定该基因片段为DEV核衣壳蛋白基因.

原位杂交技术是分子遗传学与细胞遗传学相结合而产生的一门新兴技术,具有很高的敏感性和特异性,在当今细胞生物学、分子生物学研究中有着广泛的应用.文章对原位杂交的产生和发展、基本方法和特点及其在病原微生物检测方面的研究进展进行了阐述.

根据Genbank中的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计合成一对引物,应用PCR技术扩增了GPV强毒株CHv的VP3基因片段,将扩增后的VP3基因重组到pMD18-T质粒载体上,并对擂人片段进行序列测定,将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV,M DPV,PPV和CPV等不同宿主的细小病毒的VP3进行比对分析.结果表明:中国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1 605 bp,编码 534个氨基酸,与国内外10株GPV的VP3基因进行比较,核苷酸同源性为93.4%-99.8%,氨基酸同源性为96.5%99.3%,其变异较小,是GPV保持一个血清型的分子基础.与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6%和89.9%,而与其他种属的细小病毒同源性均在30%以下,表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远.

采用超声波裂解和超速离心法提取血清2型鸭疫里默氏杆菌(RA)的外膜蛋白,在透射电镜下观察,外膜蛋白呈典型的双层泡状结构,形态主要呈O型或牙齿状或不规则的小碎片.SDS-PAGE电泳分析,血清2型RA的外膜蛋白由11条多肽组成,相对分子质量(Mr)在26 000～13 500之间,主要蛋白为31 000、33 000、75 000、101 000和116 000,其相对百分含量分别为16.97%、15.14%、13.97%、19.83%和12.69%.经免疫印迹证实,血清2型RA的40 000外膜蛋白与免疫鸭血清呈较强的阳性反应,是主要免疫原蛋白.用分离的外膜蛋白加上弗氏佐剂制备的亚单位疫苗免疫雏鸭后,可诱导产生较强的抗体,免疫鸭对同源RA菌株的攻击可产生100%的免疫保护.

应用大量生物信息学分析工具及RNA斑点杂交技术对本实验室构建鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)CHv株基因文库时新发现的dUTPase基因(GenBank登录号DQ486149)进行了分子特性及转录时相分析.研究表明:该基因大小为 1344bp,编码447个氨基酸,包含dUTPase家族蛋白的5个保守motifs,排列形式3-1-2-4-5具备Ⅱ型dUTPase的典型特征.DPV CHv dUTPase基因在25个疱疹病毒参考株之间高度保守,并与α疱疹病毒的氨基酸同源性较之与β、γ疱疹病毒要高.DPV CHv dUTPase基因转录检测发现DPV感染宿主细胞后最早30min可检测到该基因转录产物,随后转录产物量迅速放大,4h达高峰,24h后下降至相对低的水平.该研究为阐明病毒基因表达调控机理提供了有用的实验数据,并对病毒其他基因的发现和研究具有指导性意义.

对分离自鸭体的鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株(DEV-CHv)进行了适应在鸭胚成纤维细胞(DEF)上生长的研究.结果表明,DEV-CHv病死鸭肝脏悬液以绒毛尿囊腔途径经10日龄鸭胚连续传代2次,取尿囊液接种细胞的方法可获得适应DEF生长的DEV-CHv,而肝组织内病毒直接接种在DEF上则不生长.DEV-CHv刚适应DEF时以细胞变圆、折光度增强为病变特征,而适应DEF后以细胞脱落和形成圆形蚀斑为特征.适应DEF的DEV-CHv通常30h左右使细胞脱落,36 h左右在细胞单层上形成蚀斑,48 h时细胞病变可达80%以上.

将雏鹅新型病毒性肠炎病毒(NGVEV)强毒CH株经尿囊腔途径人工感染10日龄鸭胚,应用透射电镜和超薄切片技术研究病毒在宿主细胞内的形态发生及各组织器官的超微结构变化.结果表明:感染后不同时间剖杀及死亡鸭胚的尿囊膜、肠、心、肝、脑和肌胃组织中,均观察到60～70 nm的病毒粒子.病毒粒子主要通过与细胞膜融合而进入细胞质内,然后在细胞核内进行复制和装配.最后病毒粒子通过核膜和细胞膜破裂的方式被释放.病毒侵害的主要靶细胞包括鸭胚尿囊膜上皮细胞、肠上皮细胞、肠道平滑肌细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌胃黏膜上皮细胞和心肌细胞等,表现为细胞核内外膜间隙严重扩张,细胞质整体结构严重空化.病毒侵害的主要靶细胞器包括粗面内质网和线粒体,表现为粗面内质网扩张呈囊状;尿囊膜上皮细胞的线粒体出现固缩和异常聚集变化,而其他组织细胞的线粒体均表现为肿胀和嵴断裂、消失.本试验还发现NGVEV可诱导宿主细胞发生严重的细胞凋亡现象,表现为细胞皱缩,胞核内染色质密度增高,核固缩成一个或数个团块凝聚在核膜周边,胞质浓缩深染并形成凋亡小体.

探究鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)在感染7日龄雏鸭体内动态分布规律与致肝病变和诱导IFN及促炎因子表达之间的关联.以DHAV-3强毒感染7日龄雏鸭,于感染后1、3、6、9、12、24、48、72和96 h采集雏鸭的血液、肝、脾、肾、脑、胰、肺、胸腺、法氏囊、哈德氏腺和十二指肠共11种组织样品,以一步法TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测病毒含量变化、染料法实时荧光定量RT PCR检测肝中抗病毒细胞因子(IFN-a、IFN-β和IFN γ)及促炎因子(IL-1β、IL-2和IL-6)在转录水平的变化,用光学显微镜对肝组织病理学变化进行观察,分析这些变化之间的联系.结果表明:DHAV-3感染1h后即在所有的样品中检测到.组织器官中病毒含量,血液和胰分别在感染后12和96 h达到峰值,其余器官均在感染24～48 h后达到峰值.病毒含量较高的前三位器官是肝、脾和肾(分别为1011.15、1010.37和1010.30copies·g-1).肝组织病理学变化在感染3～12 h后以空泡变性为主、24～48 h以坏死为主.肝中上述6种细胞因子转录量除IL1β在12h达到最高外,其余均在感染后24～48 h达到最高,感染48 h后,其转录量变化随肝中病毒含量下降而降低,并与肝病变严重程度呈正相关.DHAV-3在雏鸭体内具有广泛的组织嗜性,肝、脾、肾是病毒攻击的主要靶器官,肝中细胞因子极有可能在抑制病毒增殖和修复组织损伤过程中发挥重要作用.