10.3969/j.issn.1001-6015.2023.03.002
骨关节炎软骨损伤中miRNA-214的作用机制及靶向基因研究
目的:探讨骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨损伤中微小RNA(micro RNA,miRNA)-214的作用机制及靶向基因.方法:①OA患者膝关节损伤软骨组织中miRNA-214表达量检测.根据软骨损伤程度Outerbridge分级标准将收集的OA患者膝关节软骨组织进行分级,分别提取各软骨组织的总RNA,逆转录cDNA后采用实时定量PCR检测损伤软骨组织中miRNA-214的表达量.②miRNA-214在OA大鼠软骨损伤中的作用机制分析.采用手术剪断大鼠前交叉韧带的方法建立大鼠OA模型.将40只造模成功的大鼠随机分为miRNA-214高表达组、miRNA-214低表达组、阴性对照组及模型组,将10只接受手术但不剪断前交叉韧带的大鼠纳入假手术组.设计、合成miRNA-214模拟物、miRNA-214抑制剂及miRNA-214阴性对照序列,构建慢病毒表达载体,完成病毒包装.在miRNA-214高表达组、miRNA-214低表达组、阴性对照组、模型组及假手术组大鼠右侧膝关节腔内分别注射100μL miRNA-214模拟物慢病毒混悬液、100μL miRNA-214抑制剂慢病毒混悬液、100μL miRNA-214阴性对照慢病毒混悬液、100μL生理盐水、100μL生理盐水.干预后4周,采集各组大鼠腹主动脉血,检测血清白细胞介素(interleukin,IL)-17、IL-23水平;制备各组大鼠膝关节软骨组织石蜡切片,HE染色后观察软骨组织病理学改变;采用免疫印迹法检测各组大鼠膝关节软骨组织中聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白(collagenⅡ,ColⅡ)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-13的蛋白相对表达量.③OA软骨损伤相关的miRNA-214靶向基因分析.检索miRNA靶基因数据库中miRNA-214的靶向基因,根据文献资料筛选与骨代谢相关的人类miRNA-214靶向基因.采用双荧光素酶实验验证miRNA-214对活化转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)的靶向性.采用免疫印迹法检测各组大鼠右侧膝关节软骨组织中ATF4的蛋白相对表达量.结果:①OA患者膝关节损伤软骨组织中miRNA-214表达量检测结果.共收集38例OA患者的膝关节软骨组织,其中Ⅲ级28例、Ⅳ级10例.Ⅳ级损伤软骨组织的miRNA-214相对表达量高于Ⅲ级(1.67±0.40,0.51±0.16,t=12.941,P=0.000).②大鼠血清炎症因子水平检测结果.5组大鼠血清IL-17、IL-23水平比较,组间差异有统计学意义[(62.94±8.12)pg·mL-1,(45.19±5.34)pg·mL-1,(44.63±6.67)pg·mL-1,(24.74±3.90)pg·mL-1,(18.15±2.33)pg·mL-1,F=94.153,P=0.000;(72.39±10.26)pg·mL-1,(48.70±5.87)pg·mL-1,(47.59±5.76)pg·mL-1,(27.54±4.05)pg·mL-1,(18.13±3.05)pg·mL-1,F=111.701,P=0.000].miRNA-214高表达组、阴性对照组、模型组及miRNA-214低表达组大鼠血清IL-17、IL-23水平均高于假手术组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);miRNA-214高表达组大鼠血清IL-17、IL-23水平均高于阴性对照组、模型组及miRNA-214低表达组(P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000);miRNA-214低表达组大鼠血清IL-17、IL-23水平均低于阴性对照组和模型组(P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000);阴性对照组大鼠血清IL-17、IL-23水平与模型组比较,组间差异均无统计学意义(P=0.838,P=0.675).③大鼠软骨组织病理学检查结果.HE染色结果显示,假手术组软骨组织潮线清晰,结构完整,软骨细胞分布均匀;阴性对照组、模型组软骨组织潮线模糊不清,结构严重破坏,软骨细胞聚集;miRNA-214高表达组软骨组织损伤情况较阴性对照组、模型组更为严重;miRNA-214低表达组软骨组织潮线可辨识,结构较为完整,软骨细胞聚集现象较阴性对照组、模型组及miRNA-214高表达组有所改善.④大鼠软骨组织聚集蛋白聚糖、ColⅡ、MMP-13蛋白表达量检测结果.5组大鼠软骨组织聚集蛋白聚糖、ColⅡ、MMP-13蛋白表达量比较,组间差异均有统计学意义(0.08±0.02,0.14±0.03,0.15±0.04,0.31±0.08,0.72±0.12,F=142.932,P=0.000;0.11±0.03,0.20±0.04,0.22±0.04,0.36±0.05,1.13±0.21,F=170.345,P=0.000;1.32±0.34,0.95±0.13,0.95±0.12,0.21±0.04,0.11±0.03,F=91.486,P=0.000).miRNA-214高表达组、阴性对照组、模型组及miRNA-214低表达组大鼠软骨组织聚集蛋白聚糖、ColⅡ蛋白表达量均低于假手术组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000),MMP-13蛋白表达量高于假手术组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);miRNA-214高表达组大鼠软骨组织聚集蛋白聚糖、ColⅡ蛋白表达量均低于阴性对照组、模型组及miRNA-214低表达组(P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000),MMP-13蛋白表达量高于阴性对照组、模型组及miRNA-214低表达组(P=0.005,P=0.004,P=0.000);miRNA-214低表达组大鼠软骨组织聚集蛋白聚糖、ColⅡ蛋白表达量均高于阴性对照组和模型组(P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000),MMP-13蛋白表达量低于阴性对照组和模型组(P=0.000,P=0.000);阴性对照组大鼠软骨组织聚集蛋白聚糖、ColⅡ、MMP-13蛋白表达量与模型组比较,组间差异均无统计学意义(P=0.535,P=0.278,P=1.000).⑤miRNA-214靶向基因验证结果.在转染ATF4-WT-psiCHECK2质粒的293T细胞中,miRNA-214模拟物组的荧光酶相对活性小于miRNA-214阴性对照组(0.45±0.07,1.02±0.23,t=5.301,P=0.001);在转染ATF4-MUT-psiCHECK2质粒的293T细胞中,miRNA-214模拟物组的荧光酶相对活性与miRNA-214阴性对照组比较,差异无统计学意义(1.05±0.19,1.03±0.18,t=0.171,P=0.869).⑥大鼠软骨组织中ATF4蛋白表达量检测结果.5组大鼠软骨组织ATF4蛋白表达量比较,组间差异有统计学意义(0.11±0.03,0.17±0.03,0.18±0.04,0.31±0.05,0.79±0.11,F=213.111,P=0.000).miRNA-214高表达组、阴性对照组、模型组及miRNA-214低表达组大鼠软骨组织ATF4蛋白表达量均低于假手术组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);miRNA-214高表达组大鼠软骨组织ATF4蛋白表达量低于阴性对照组、模型组及miRNA-214低表达组(P=0.000,P=0.000,P=0.000);miRNA-214低表达组大鼠软骨组织ATF4蛋白表达量高于阴性对照组和模型组(P=0.000,P=0.000);阴性对照组大鼠软骨组织ATF4蛋白表达量与模型组比较,组间差异无统计学意义(P=0.535).结论:OA患者膝关节软骨损伤与软骨组织中miRNA-214的表达有关,抑制miRNA-214表达能够减轻大鼠膝关节炎症反应、减少软骨基质降解、促进软骨修复,miRNA-214的作用机制与其抑制IL-17、IL-23、MMP-13表达和促进聚集蛋白聚糖、ColⅡ、ATF4表达有关,ATF4可能是与OA软骨损伤相关的miRNA-214的靶基因之一.
骨关节炎、软骨疾病、微RNAs、基因表达、大鼠、动物实验
35
R285.5;R684.3;R318
2023-04-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共10页
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