PTEN shRNA慢病毒载体构建及转染人子宫腺肌病细胞的稳定细胞株筛选

摘要：

目的 构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的第10染色体丢失的磷酸酶基因(phasphatase and tensin homo-log deleted in chromosome 10,PTEN)的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,并在转染人子宫腺肌病(adenomyosis,AM)细胞后筛选最优稳转株.方法 设计合成3条特异性针对人PTEN基因的shRNA序列,构建到pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO载体中,测序鉴定载体构建情况,进而包装病毒并检测滴度.筛选出最优感染复数(multiplicity of infection,MOI)、嘌呤霉素杀灭浓度后,用慢病毒液转染AM细胞,以嘌呤霉素药筛建立PTEN敲低的稳定细胞株,采用实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测转染后细胞内PTEN mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测PTEN蛋白表达水平,以检验转染效率并筛选出干扰效率最佳的shRNA序列.结果 成功构建了3个PTEN shRNA慢病毒载体,包装后以MOI为50转染AM细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达明显,嘌呤霉素持续药筛建立了PTEN敲低的稳定细胞株,以PTEN shRNA3慢病毒载体的干扰效率最佳(92.98％).结论 成功构建了PTEN shRNA慢病毒载体,并在体外有效转染了AM细胞,建立了PTEN敲低的稳定细胞株.

关键词：子宫腺肌病、慢病毒、PTEN、shRNA、稳定细胞株

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分类号：R329.2;R711.71;R285.5(人体形态学)

资助基金：国家自然科学基金;国家自然科学基金;广东省中医药局项目;国家自然科学基金;广州中医药大学优秀博士学位论文培育项目

在线出版日期：2019-08-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：990-995