基于原生质体转化的甘蔗梢腐病菌YN41基因敲除体系的构建

摘要：

基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段,为了深入研究甘蔗梢腐病菌致病基因的功能,构建了梢腐病菌YN41菌株的基因敲除体系.本研究构建了基于线性DNA的同源重组基因敲除技术,融合PCR构建敲除盒即带有潮霉素基因标记的线性DNA融合片段,配置0.05 g·mL-1溶壁酶+0.01 g·mL-1崩溃酶的复合酶液28℃酶解3 h获得了高产量的原生质体,利用聚乙二醇(PEG)介导的原生质体的转化,PCR鉴定技术和酶切鉴定技术对转化子进行鉴定,荧光定量PCR分析和Southern Blot方法进一步对基因缺失突变体进行验证,生物学表型(菌落形态、生长速率、产孢量、生物量和致病力)验证了 PK基因敲除体系的成功构建.28℃酶解3h获得了 2×107个·mL-1原生质体;对编码丙酮酸激酶的PK基因进行了基因敲除验证,获得了纯合敲除突变体;荧光定量PCR检测转录水平无表达;Southern Blot结果显示使用PK基因探针杂交,基因缺失突变体无条带,野生型杂交到目的条带;生物学表型验证了PK基因敲除突变体对比野生型菌丝色素加深,生长速率先慢后快、产孢量增加,致病力增强,成功构建了 PK基因敲除突变体.甘蔗梢腐病菌YN41基因敲除体系的成功构建,为甘蔗梢腐病菌致病基因的功能研究提供了技术平台.

关键词：甘蔗梢腐病、层出镰刀菌、基因敲除、原生质体制备、转化

所属期刊栏目：53

分类号：S435.661(病虫害及其防治)

资助基金：广西壮族自治区硕士研究生创新项目YCSW2020026

在线出版日期：2023-03-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共12页

页码：72-83