香蕉束顶病毒海口分离物Rep基因的克隆、原核表达、抗血清制备及检测

摘要：

[目的]对香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)海口分离物起始蛋白(replication initiation proteins,Rep)基因进行克隆、原核表达、抗血清制备,为BBTV有效的检测及分子流行病学等研究莫定基础.[方法]以海口地区染病香蕉幼嫩假茎和叶片的总DNA为模板,通过PCR技术克隆BBTV海口分离物的起始蛋白基因,连接到表达载体并进行大肠杆菌原核表达,制备高效价特异性抗血清.[结果]应用PCR方法从染毒香蕉幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增复制rep基因,回收目的片段后经酶切,获得了含BBTV Rep基因的重组质粒pET32b-Rep.将重组质粒转化E.coli BL21(DE3 ),经不同的时间、温度及IPTG浓度优化,12% SDS-PAGE电泳分析,在20℃,0.1 mmol/L IPTG条件诱导4h,最终获得大量的可溶性融合蛋白.将可溶性蛋白上清液经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,得到高纯度的融合蛋白.用纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了BBTV Rep蛋白抗血清.以融合蛋白做抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000.以田间样品做抗原时,结果表明抗血清最佳工作浓度为1:1 000.Western blot鉴定结果表明抗血清能与融合蛋白特异性结合.[结论]利用Rep基因制备的特异性抗血清在BBTV病毒粒体的组装机制研究及病毒病诊断上具有重要的应用价值.

关键词：香蕉束顶病毒、Rep基因、原核表达、抗血清制备

所属期刊栏目：37

分类号：S436.67(病虫害及其防治)

资助基金：国家自然科学基金项目31070131;教育部/海南省教育厅联合资助博士点基金项目20050565002;中央级公益性科研院所基本科研业务费专项ITBBZD0754

在线出版日期：2012-01-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：38-43