基于FPLC-LC-MS/MS分析嗜盐古菌Haloarcula hispanica胞内类泛素化底物

摘要：

本研究结合SLIC克隆技术和快速蛋白质液相色谱-高效液相色谱-串联质谱(FPLC-LC-MS/MS)法,对嗜盐古菌Haloarcula hispanica类泛素蛋白ThiS的泛素化底物和缀合位点进行鉴定分析.采用SLIC克隆法构建类泛素蛋白ThiS表达质粒/整合质粒,经转染后的菌株在DMSO呼吸作用诱导下表达并纯化His6-ThiS蛋白缀合体.通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,质粒型类泛素ThiS的表达远远高于基因型菌株的表达量,而通过定点突变,将ThiS的第89号位点突变成赖氨酸K和精氨酸R,进而使用胰蛋白酶对ThiS肽段上的赖氨酸残基-双甘氨肽标签进行酶切处理,采用LC-MS/MS法鉴定其底物和底物修饰位点.鉴定得到钼喋呤合成酶MoaE,蛋氨酸亚砜还原酶MsrA和其同系物MsrB,以及Fe-S簇组装蛋白SufB等4种底物蛋白.该方法通过结合蛋白位点突变和质谱检测,能够准确、有效地检测泛素/类泛素蛋白的修饰底物及其修饰位点,为深入泛素的生物性功能研究提供了切入点.

关键词：类泛素、LC-MS/MS、SLIC克隆、嗜盐古菌、蛋白缀合

所属期刊栏目：38

分类号：O657.63(分析化学)

资助基金：国家自然科学基金31670658

在线出版日期：2017-06-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：272-281