基于CRISPR/Cas9技术的SRSF9基因敲除对成胶质细胞瘤生物学功能的影响

摘要：

目的:基于成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats,CRISPR) /Cas9系统构建富含丝氨酸/精氨酸剪切因子9(serine-arginine-rich splicing factor 9,SRSF9)基因敲除的人脑胶质瘤U87稳定细胞株,研究SRSF9在人成胶质细胞瘤中的生物学功能.方法:利用CRISPR/Cas9系统构建3个针对SRSF9基因的单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA),将其转入胶质瘤U87细胞后,采用蛋白质印迹法鉴定SRSF9基因敲除效率.采用有限稀释法挑选出3株SRSF9基因敲除的U87单克隆细胞株并扩增,采用CCK-8法和EdU掺入的FCM法检测细胞体外增殖能力,采用平板克隆形成实验和干细胞成球实验分别检测细胞体外克隆形成和成球的能力,采用裸鼠皮下成瘤实验检测细胞体内成瘤的能力.结果:3条sgRNA成功插入慢病毒载体中,且序列正确.经慢病毒感染效率分析及蛋白质印迹法鉴定证明,SRSF9基因敲除的U87多克隆细胞株构建成功;经蛋白质印迹法和DNA测序确认SRSF9基因敲除的U87单克隆细胞株构建成功,序列发生移码突变.SRSF9基因敲除后,U87单克隆细胞的增殖和克隆形成能力均明显降低(P值均＜0.05),肿瘤干细胞成球能力也明显下降(P＜0.001),而且在裸鼠体内的成瘤能力明显减弱(P＜0.01).结论:成功建立基于CRISPR/Cas9技术的SRSF9基因敲除的脑胶质瘤U87细胞株,并通过功能实验证明SRSF9是成胶质细胞瘤的一个关键致癌基因.

关键词：神经胶质瘤、基因敲除技术、细胞增殖、基因、SRSF9、CRISPR/Cas9技术

所属期刊栏目：38

分类号：R730.264(肿瘤学)

资助基金：国家自然科学基金;人才培养项目;江苏省自然科学基金;人才培养项目

在线出版日期：2018-12-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：1011-1021