慢病毒介导的p21/Waf1基因沉默增强膀胱癌特异性溶瘤腺病毒的复制及对EJ细胞增殖的抑制作用

摘要：

目的:沉默人膀胱癌EJ细胞中p21/Waf1基因的表达,并探讨p21/Waf1表达下调对膀胱癌特异性溶瘤腺病毒复制及对EJ细胞增殖的影响.方法:设计并合成特异性针对p21/ Waf1基因的shRNA,插入含绿色荧光蛋白(green f1uorescent protein,GFP)编码基因的pMagic 7.1载体,构建p21/Waf1-shRNA重组慢病毒质粒pLVT1051,并进行PCR和测序鉴定.将pLVT1051、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三种质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒.将携带有p21/Waf1-shRNA的慢病毒感染EJ细胞,采用嘌呤霉素筛选p21/Waf1-shRNA稳定转入的EJ细胞,采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测p21/Waf1-shRNA稳定感染后EJ细胞中p21/waf1 mRNA和蛋白的表达水平.将膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad/PSCAE/UP Ⅱ /E1A感染p21/waf1基因沉默的EJ细胞,采用蛋白质印迹法检测病毒复制相关指标E1A和Hexon蛋白的表达水平,MTT法检测腺病毒Ad/PSCAE/UP Ⅱ/E1A对EJ细胞增殖的影响.结果:成功构建了携带有p21/Waf1-shRNA的重组慢病毒表达载体并获得相应的慢病毒;经嘌呤霉素筛选2周后成功获得稳定感染的EJ细胞.p21/Waf1-shRNA能明显降低EJ细胞中p21/Waf1 mRNA及蛋白的表达水平,差异均有统计学意义(P值均＜ 0.05).膀胱癌特异性溶瘤腺病毒(Ad/PSCAE/UP Ⅱ/E1A)作用于p21/waf1基因沉默的EJ细胞后,其病毒复制相关指标E1A和Hexon的表达水平明显上调,对EJ细胞的增殖抑制作用明显增强(P＜0.01).结论:成功建立了P21/Waf1基因沉默表达的EJ细胞,沉默p21/Waf1基因的表达能增强膀胱癌特异性溶瘤腺病毒的复制能力,并对EJ细胞的增殖有明显的抑制作用.

关键词：膀胱肿瘤、RNA、小分子干扰、慢病毒感染、p21/Waf1基因、病毒复制、EJ细胞

所属期刊栏目：35

分类号：R737.14(肿瘤学)

在线出版日期：2015-11-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：1083-1091