微小RNA-181a在人食管癌EC9706细胞中对靶基因PRDM1调控作用的研究

摘要：

目的:构建微小RNA (microRNA,miR) -181a的真核表达载体和靶基因PRDM1 (encoding PR domain containing 1,with ZNF domain)的3'非翻译区(3'-untranslated region,3'UTR)荧光素酶报告载体,在人食管癌EC9706细胞中验证miR-181a对靶基因PRDM1的调控作用.方法:根据miR-181a成熟序列在基因组中的位置及其上下游200个碱基序列,以人食管癌KYSE150细胞基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增包含miR-181a前体的序列,克隆到线性化的pMD18-T Simple载体中,经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后亚克隆到质粒pCDNA3.1(+)上,对重组质粒进行酶切鉴定和测序分析.通过实时定量PCR法检测人食管癌EC9706细胞转染重组表达载体pCDNA3.1-miR-181a后成熟miR-181a的表达水平.应用生物信息学预测软件对miR-181a的靶基因进行预测,将候选靶基因PRDM1的3'UTR融合到pMIR荧光素酶基因下游,通过双荧光素酶报告基因检测miR-181a对靶基因PRDM1 3UTR的调控作用.将pCDNA3.1-miR-181a表达质粒转染到人食管癌EC9706细胞中,蛋白质印迹法检测其对PRDM1蛋白表达的影响.结果:成功构建miR-181a真核表达载体,实时定量PCR验证表明pCDNA3.1-miR-181a在EC9706细胞中能够过表达成熟miR-181a.生物信息学预测PRDM1可能是miR-181a的靶基因之一,于是构建了PRDM1的3'UTR荧光素酶报告载体pMIR-PRDM1,在此基础上对PRDM1的3'UTR“种子区”进行定点突变.双荧光素酶报告基因分析表明,miR-181a能够作用于PRDM1基因的3' UTR.蛋白质印迹法进一步证实,miR-181a能够抑制性调控内源性PRDM1蛋白的表达.结论:MiR-181a作用于PRDM1基因的3'UTR,在转录后水平上调PRDM1蛋白的表达,提示PRDM1是miR-181a直接调控的靶基因.

关键词：食管肿瘤、微小RNA类、基因表达调控、miR-181a、PRDM1基因

分类号：R735.1(肿瘤学)

在线出版日期：2011-12-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：813-818