用于筛选脑出血相关基因的斑马鱼模型的构建

摘要：

目的:构建斑马鱼脑出血模型，并以此筛选诱导斑马鱼脑出血的相关基因。方法:通过吗啉代寡核苷酸（MO）技术和单细胞显微注射技术构建斑马鱼脑出血模型，并从宏观、微观角度多重验证。首先，造模实验采用注射Control MO的正常野生型AB品系斑马鱼作为对照组，实验组在AB斑马鱼胚胎单细胞时期分别注射神经嵴源性细胞（NCDCs）发育相关基因的MO，包括col8a1 MO、tfap2α MO、msx1a MO、msx2 MO、dkk1a MO等，于显微镜白光视野下初步验证模型。其次，采用Tg（flk1：GFP；gata1：dsRed）双转基因斑马鱼进行模型验证，该转基因鱼用绿色荧光蛋白（GFP）标记血管内皮细胞，用红色荧光蛋白（dsRed）标记血红细胞，能够更清晰地观察到斑马鱼脑出血的部位。在斑马鱼胚胎单细胞时期注射Control MO 作为对照组，注射col8a1 MO作为实验组，正常培养至受精后48 h通过激光共聚焦观察红细胞渗漏情况，构建荧光视野可观察的脑出血模型。最后，采用Tg（flk1：GFP）转基因斑马鱼进行基于血脑屏障的模型验证，通过Dextran-Rhodamin和DAPI染料的渗漏现象进一步明确斑马鱼血脑屏障的破坏与脑出血的发生，并进行定量统计，从而验证NCDCs发育相关基因与脑出血表型的关系，证明造模有效。结果:与注射Control MO的正常野生型AB品系斑马鱼对照组相比，col8a1、tfap2α和msx1基因突变的实验组斑马鱼有明显的脑出血现象，出血比例分别为18.18%（52/286）、23.04%（62/251）、35.94%（23/64），而msx2和dkk1a基因突变的斑马鱼极少观察到脑出血，出血比例仅分别为1.03%（1/97）和1.15%（1/87）。注射Control MO与col8a1 MO的Tg（flk1：GFP；gata1：dsRed）双转基因斑马鱼红细胞渗漏发生率分别为0.37%（1/273）与18.18%（52/286）（
P<0.001）。注射Control MO与col8a1 MO组Tg（flk1：GFP）转基因斑马鱼DAPI阳性的细胞核数分别为（10.05±5.27）个与（60.35±3.96）个（
P<0.001）；Dextran-Rhodamin染料渗漏引起的中脑实质荧光示踪强度值分别为2.54±4.70与5.13±3.52（
P<0.001），两组比较差异有统计学意义。
结论:本研究成功构建了斑马鱼脑出血模型，并筛选出col8a1、tfap2α、msx1等诱导斑马鱼脑出血的相关基因。

关键词：脑出血、斑马鱼、血脑屏障、渗漏、基因

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资助基金：国家重点研发计划2018YFA0108603，2018YFA0108604;四川大学华西医院学科卓越发展1·3·5工程临床研究孵化项目2018HXFH007，2021HXFH014;华西医院院-企合作临床研究创新项目2019HXCX07;National Key Research and Development Program of China2018YFA0108603, 2018YFA0108604;1·3·5 Project for Disciplines of Excellence-Clinical Research Incubation Project, West China Hospital, Sichuan University2018HXFH007, 2021HXFH014;Clinical Research Innovation Project, West China Hospital, Sichuan University2019HXCX07

在线出版日期：2023-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：2619-2623