缺氧复氧环境对成骨细胞自噬水平的影响

摘要：

目的 探讨缺氧复氧环境对成骨细胞自噬水平的影响.方法 取24～ 48 h内新生SD大鼠的头盖骨,通过组织块贴壁法培养和差速离心法纯化成骨细胞,采用茜素红染色和碱性磷酸酶染色法对成骨细胞矿化钙结节及成骨细胞生物学特性进行鉴定.将第3代成骨细胞在正常状态下培养,并随机分为4组:A组在正常状态下培养36 h;B组在正常状态下培养18h,再在缺氧状态下培养18h;C组在缺氧状态下培养36 h;D组在缺氧状态下培养18h,再在正常状态下培养18h.培养结束后观察4组细胞形成矿化钙结节的能力,同时采用CCK-8法检测细胞增殖活性.随后采用定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测自噬特异性基因Beclin1、微管相关蛋白轻链3(LC3)及成骨细胞特异性基因胶原蛋白Ⅰ (COL-Ⅰ)和骨形态发生蛋白2(BMP-2)的表达.免疫蛋白印迹技术检测成骨细胞自噬蛋白Beclin 1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及自噬选择性底物P62蛋白的表达.组间数据比较采用单因素方差分析.结果 4组成骨细胞培养18d后通过茜素红染色发现A组成骨细胞矿化钙结节能力最强,而B、C和D组矿化钙结节能力明显降低,且D组最低.CCK-8检测各组成骨细胞增殖活性发现,A组为98％±8％,B组为90％±8％,C组为82％±9％,D组为76％±8％,各组间差异有统计学意义(F=35.764,P=0.000).RT-PCR结果显示Beclin1、LC3-ⅡmRNA的表达量各组逐渐增高,且D组＞C组＞B组＞A组(F=38.327、16.583,均P＜0.05);COL-Ⅰ、BMP-2 mRNA的表达量逐渐降低,且A组＞B组＞C组＞D组(F=20.387、12.426,均P＜0.05).免疫蛋白印迹结果显示各组Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达量逐渐增高,且D组＞C组＞B组＞A组(F=26.843、28.576,均P＜0.05),P62蛋白表达逐渐降低,且A组＞B组＞C组＞D组(F=18.946,P=0.011).结论 缺氧复氧环境会降低成骨细胞增殖活性,诱导上调成骨细胞自噬相关基因的表达.缺氧复氧环境在一定时间范围内会促进成骨细胞自噬水平的增加.

关键词：成骨细胞、自噬、氧环境、缺氧复氧、细胞增殖

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资助基金：国家自然科学基金项目81341054,81171732;皖南医学院人才引进基金YR201411National Natural Science Foundation of China81341054,81171732;Research Foundation for Talented Scholars of Wannan Medical CollegeYR201411

在线出版日期：2019-05-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：844-849