新型10-23脱氧核酶表达载体的构建及其效能研究

摘要：

目的 构建一种新型10-23脱氧核酶(DZ)真核表达载体,并鉴定其在细胞内表达10-23DZ的能力以及10-23DZ抑制巨噬细胞TACO表达的效果.方法 设计1条寡脱氧核糖核苷酸ODN-PSL,其序列包含鼠莫洛尼白血病病毒逆转录酶(MLV-RT)的引物结合序列、1个多克隆酶切位点(MCS)及1个逆转录终止信号序列.将ODN.PSL插入框架质粒pBUDCE4.1中启动子P_(CMV)的下游,获取重组质粒pBUD-PSL.将MLV-RT的编码基因克隆至pBUD-PSL中另一启动子P_(EF-1α)的下游,构建重组质粒pSDE01.将pSDE01转染入鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,采用RT-PCR方法鉴定细胞中MLV-RT的表达及其表达产物的逆转录酶活性.通过计算机软件模拟巨噬细胞TACO mRNA的二级结构,以此确定10-23DZ的作用靶位并设计一相应的10-23DZ-DZ1,将DZI表达序列插入pSDE01中ODN-PSL的MCS中,获取重组表达载体pSDE01-DZ1.将pSDE01-DZ1转染入RAW264.7细胞,并设未转染对照组.转染后48 h,采用PCR法和斑点杂交方法鉴定DZ1在细胞中的表达;并分别采用半定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测TACO mPNA和蛋白的表达,各组实验均独立重复3次.结果 限制性内切酶酶切及测序结果显示pSDE01构建成功,将其转染入RAW264.7细胞后检测到MLV-RT的表达,而且表达产物具有逆转录酶活性.pSDE01-DZ1转染入RAW264.7细胞后48 h,PCR和斑点杂交方法均检测到DZ1的表达;半定量RT-PCR和蛋白质印迹检测结果显示,与未转染组相比,pSDE01-DZ1转染后48 h巨噬细胞TACO mRNA表达水平下降了77.7%(0.193 ±0.008比0.864 ±0.005,P＜0.05),TACO蛋白表达最下降了73.3%(0.114 ±0.051比0.427 ±0.043,P＜0.05).结论 成功构建了一种操作简便的新型10-23DZ表达载体,所携带的特异性10-23DZ可在细胞内有效表达,并抑制相应靶基因的表达.

关键词：DNA、催化性、表达载体、微丝蛋白质类、巨噬细胞

所属期刊栏目：89

分类号：R9(药学)

资助基金：国家自然科学基金30600528

在线出版日期：2009-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：2708-2712