小胶质细胞参与视网膜神经节细胞死亡机制的实验研究

摘要：

目的 探讨小胶质细胞活化在急性高眼压引起的视网膜缺血再灌注损伤视网膜神经节细胞(RGC)死亡中的作用及其机制.方法 实验研究.取C57BL/6小鼠原代RGC与小鼠小胶质细胞BV2细胞共培养或单独培养,建立体外氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型模拟体内视网膜缺血再灌注损伤(复氧时间分别设为6h、24h、36 h、48 h),使用小胶质细胞特异性离子钙接头蛋白(ibal)免疫荧光染色评估BV2细胞活化程度;采用活细胞计数试剂盒检测RGC的细胞活性;应用细胞凋亡检测试剂盒检测RGC凋亡率;通过半定量逆转录PCR、Western印迹、细胞免疫荧光检测BV2细胞中Toll样受体-4(TLR4)与Nod样受体家族含pyrin结构域蛋白3(NLRP3)的mRNA及蛋白水平;应用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(caspase-8)染色试剂盒检测BV2细胞中caspase-8活性;酶联免疫吸附试验检测BV2细胞上清液中白细胞介素1β(IL-1β)含量;应用TLR4小干扰RNA(siRNA)转染和caspase-8抑制剂阻断相应通路,对比TLR4、NLRP3的表达、caspase-8的活性变化、IL-1β含量的差异以及共培养RGC的细胞活性变化.采用方差分析进行统计学分析.结果 RGC与BV2细胞共培养下,细胞免疫荧光检测显示OGD/R模型中BV2细胞iba1表达增多,BV2细胞显著激活.RGC与BV2细胞共培养下,OGD/R模型中RGC的凋亡率(71.1％±3.2％)高于RGC单独培养下OGD/R模型中RGC的凋亡率(35.1％±1.8％),差异有统计学意义(t=10.10,P＜0.01).细胞免疫荧光检测显示BV2细胞单独培养下,OGD/R模型中BV2细胞TLR4、NLRP3表达显著增加,其mRNA水平均随复氧时间延长显著上升,差异均有统计学意义(F=64.45,72.74;均P＜0.01),且在OGD/R复氧24h时达到峰值(TLR4 mRNA与对照的相对比值为2.83±0.23,NLRP3 mRNA与对照的相对比值为3.12±0.27);caspase-8的活性也随复氧时间延长显著增加,差异有统计学意义(F=93.57,P＜0.01),且在OGD/R复氧24h时达到峰值(与对照的相对比值为2.92±0.31).应用TLR4 siRNA转染BV2细胞后其caspase-8的活性明显受到抑制,应用caspase-8抑制剂并不影响BV2细胞中TLR4的表达上调,而OGD/R作用下BV2细胞分泌的成熟IL-1β在caspase-8抑制剂干预下显著减少(由3.52±0.55降低为1.39±0.37,t=7.19,P＜0.01),同时NLRP3的表达量在caspase-8抑制剂干预下显著降低(由2.79±0.23降低至1.37±0.19,t=9.37,P＜0.01).OGD/R模型中,与TLR4 siRNA转染BV2细胞共培养的RGC细胞活性为74.5％±1.2％,与经caspase-8抑制剂处理BV2细胞共培养的RGC细胞活性为62.8％±1.5％,均高于与对照BV2细胞共培养的RGC细胞活性(36.7％±0.3％),差异均有统计学意义(t=11.60,6.83;均P＜0.01).结论 视网膜缺血再灌注损伤促使小胶质细胞活化,激活TLR4-caspase-8-NLRP3炎性反应小体信号通路,介导RGC死亡.

关键词：高眼压、再灌注损伤、小神经胶质细胞、视网膜神经节细胞、细胞死亡、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8

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资助基金：国家自然科学基金青年基金;Youth Project of National Natural Science Foundation of China

在线出版日期：2020-04-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：32-40