微小RNA-1在氧化应激下对人小梁网细胞中纤维连接蛋白表达的调节作用

摘要：

目的 探讨氧化应激下微小RNA-1 (miR-1)在人小梁网细胞(HTMC)中的表达及其对纤维连接蛋白(FN)的表达调控作用.方法 实验研究.分别用0、60、100、200、400 μmol/L H2O2对HTMC进行刺激6h;刺激后的细胞在体外培养24 h,随后采用实时荧光定量PCR检测各组细胞miR-1和FN的表达情况.根据生物信息学分析预测出miR-1的靶基因为FN;分别构建pcDNA3/pri-miR-1、pcDNA3/增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-FN-3'-非翻译区(3'-UTR)和pcDNA3/EGFP-FN突变体3'-UTR(FN-3'UTRmut)载体并转染HTMC,使用红色荧光蛋白(RFP)表达质粒pDsRed2-N1作为内参,转染48 h后检测EGFP和RFP的吸光度,以探究miR-1对FN表达的影响.过表达miR-1载体转染HTMC后用200 μmol/LH2O2刺激24 h,采用实时荧光定量PCR法、蛋白免疫印迹法和荧光免疫组织化学染色分别检测FN mRNA和蛋白的表达变化.采用单因素方差分析以及两样本t检验对数据进行统计学分析.结果 随着H2O2浓度升高,miR-1的水平逐渐下降(F=390.80,P＜0.01),而FN的水平逐渐升高(F=13.16,P＜0.01).与对照(1.000)相比,200 μmol/L和400 μmol/L H2O2刺激后的HTMC中miR-1水平分别下降至0.608±0.014(t=21.67,P＜0.01)和0.409 ±0.020 (t=29.91,P＜0.01),FN的mRNA水平分别上升至1.630±0.233(t=4.47,P=0.011)和1.903 ±0.246 (t=6.15,P=0.003).通过生物信息学分析,预测到miR-1在FN的mRNA 3'-UTR上存在可能的结合位点,双荧光检测发现:pcDNA3/pri-miR-1和pcDNA3/EGFP-FN-3'UTRmut共转染的细胞EGFP表达(0.562±0.018)高于pcDNA3/pri-miR-1和pcDNA3/EGFP-FN-3'UTR共转染细胞(0.329±0.015)(t=17.39,P＜0.01).与对照(1.000)相比,过表达miR-1时FN的mRNA表达量下降至0.294±0.081(t=1 1.01,P＜0.01);蛋白水平减少至0.584±0.022(t=5.57,P＜0.01).结论 氧化应激下HTMC中miR-1水平降低,而FN的表达升高;miR-1通过靶定FN的3'-UTR来抑制FN的表达.

关键词：微RNAs、氧化性应激、小梁网、纤连蛋白类

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资助基金：国家自然科学基金81270994,81070725National Nature Science Foundation of China 81270994,81070725

在线出版日期：2019-06-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：355-360