EphA2基因过表达对高浓度地塞米松作用的人晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响

摘要：

目的 探讨构建人生促红素人肝细胞受体酪氨酸激酶A2(EphA2)基因慢病毒表达载体并体外转染人晶状体上皮细胞(HLE-B3系)的可行性及EphA2基因过表达对大剂量地塞米松作用的HLE-B3增殖及凋亡的影响.方法 实验研究.骨架质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP经NOT Ⅰ、Xba Ⅰ双酶切线性化后和目的基因EphA2重组.重组产物转化大肠杆菌DH10B.以菌落PCR、酶切和DNA测序鉴定.采用脂质体2000转染表达载体至人293T/17细胞包装慢病毒.按感染复数(MOI)分别为20、50、100、200体外转染人HLE-B3,72 h后荧光显微镜下观察细胞形态;流式细胞术检测转染效率.选择最佳MOI进行实验,免疫印迹法检测正常对照组、空载体转染组及EphA2基因慢病毒表达载体转染组EphA2蛋白的表达.后续实验分为以下四组:A组(正常对照组)、B组(EphA2基因慢病毒表达载体转染组)、C组(地塞米松组)和D组(EphA2基因慢病毒表达载体转染联合地塞米松组).细胞计数试剂盒法(CCK-8)检测各组细胞存活率,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测各组细胞凋亡指数.采用单因素方差分析或双因素方差分析对相应实验数据进行统计学分析.结果 PCR、酶切和DNA测序鉴定均证实EphA2以正确的序列和方式成功插入载体.MOI为20、50、100、200时,转染效率分别为38.6％±3.9％、49.2％±4.2％、79.5％±5.5％、80.2％±6.0％.其中,MOI 100与200比较,转染效率无明显提高(P=2.507),但细胞形态变得不规则,确定最佳MOI为100.空载体转染组与正常对照组比较,EphA2蛋白相对表达量差异无统计学意义(P=0.868);EphA2基因慢病毒表达载体转染组EphA2蛋白相对表达量较正常对照组提高了4.4倍,差异有统计学意义(P=0.001).A组、B组、C组和D组细胞存活率分别为98.18％±1.85％、122.01％±3.89％、52.32％± 1.99％和76.18％±3.74％;组间比较,差异有统计学意义(F=497.6,P=0.001);两两比较差异均有统计学意义(P值均为0.001).A组、B组、C组和D组细胞凋亡指数分别为5.4％±1.5％、5.0％±1.8％、23.0％±3.9％、14.4％±2.7％;组间比较,差异有统计学意义(F=397.6,P=0.001);两两比较,A组与B组间差异无统计学意义(P=0.415),余两两比较差异均有统计学意义(P值均为0.001).结论 成功构建人EphA2基因慢病毒表达载体并实现了其在HLE-B3中的高效表达.EphA2基因过表达对HLE-B3具有促增殖作用,对地塞米松导致的HLE-B3增殖抑制具有保护作用.EphA2基因过表达对HLE-B3生理状态下的细胞凋亡无保护作用,对地塞米松导致的HLE-B3凋亡具有保护作用.

关键词：晶体、上皮细胞、受体、EphA2、地塞米松、细胞增殖、细胞凋亡、转染

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资助基金：国家自然科学基金81270986National Natural Science Foundation of China 81270986

在线出版日期：2018-04-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：125-132