单分子成像显示视网膜血管内皮细胞膜上血管内皮生长因子受体2聚集状态

摘要：

目的:观察单个视网膜血管内皮细胞膜上血管内皮生长因子受体2 （VEGFR2）的聚集状态。方法:将猴视网膜血管内皮细胞（RF/6A）分为空白对照组（正常培养）、质粒转染组[转染VEGFR2-绿色荧光蛋白（GFP）重组质粒]。采用共聚焦显微镜观察质粒转染组GFP的表达；实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）、蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞中VEGFR2的mRNA和蛋白表达情况；单分子成像技术记录细胞膜上表达的单个VEGFR2-GFP分子的荧光强度分布和漂白步数，判断受体的寡聚或多聚状态。结果:共聚焦显微镜观察发现，转染12 h后，质粒转染组细胞可见GFP绿色荧光。qPCR检测结果显示，质粒转染组细胞中VEGFR2、GFP mRNA表达较空白对照组显著升高，差异均有统计学意义（
t=11.240、12.330，
P<0.001、0.001）。Western blot检测结果显示，质粒转染组细胞VEGFR2蛋白表达较空白对照组增强，差异有统计学意义（
t=8.346，
P<0.01 ）。单分子成像结果显示，无配体刺激时RF/6A细胞膜表面上VEGFR2- GFP的荧光强度分布为双峰，其中单体、二聚体比例分别为86.0%、14.0%；通过计数GFP荧光漂白步数，静息状态下受体单体、二聚体、三聚体和四聚体比例分别为81.4%、12.9%、5.5%、0.3%。
结论:无配体状态下，VEGFR2在RF/6A细胞膜表面以单体和包括二聚体在内的多聚体形式共存，以单体为主。

关键词：血管内皮生长因子受体2、视网膜血管、内皮细胞、单分子成像

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资助基金：国家自然科学基金（青年项目）81900894;天津市自然科学基金青年项目18JCQNJC11300;天津市临床重点学科（专科）建设项目TJLCZDXKQ004;天津市视网膜功能与疾病重点实验室自主与开放课题2019tjswmm004;National Natural Science Foundation of China Youth Project81900894;The Young Scientists Fund of Tianjin Natural Science Foundation18JCQNJC11300;Tianjin Key Clinical Discipline Specialty ProjectTJLCZDXKQ004;Independent and open project of Tianjin Key Laboratory of retinal function and disease2019tjswmm004

在线出版日期：2023-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：138-144