新型光遗传学工具Channelrhodopsin-XXM2.0和 PsCatCh2.0恢复视觉功能的可行性分析

摘要：

目的:探讨新型光遗传学工具Channelrhodopsin-XXM2.0 （XXM2.0）、Channelrhodopsin-
PsCatCh2.0 （
PsCatCh2.0）的光敏感性及动力学特征，分析其是否可用于光遗传学视觉功能的恢复。
方法:通过分子生物学技术将XXM2.0和
PsCatCh2.0的基因片段连接到包含抗氨苄青霉素筛选基因和报告基因的载体pCIG （c）-msFoxn3上，形成新质粒pCIG （c）-msFoxn3-XXM2.0、pCIG （c）-msFoxn3-
PsCatCh2.0。将构建的新质粒转染到HEK 293T细胞上，用HEKA膜片钳系统行全细胞模式记录对光反应。在2.7×10
16、4.7× 10
15、6.4×10
14 photons/ （cm
2·s）的光强下记录电流大小；在2.7×10
16 photons/ （cm
2·s）光强下刺激XXM2.0、
PsCatCh2.0并让其充分恢复，在Clampfit 10.6软件中分析开放和关闭时间常数；在相同光强下，设置2~ 32 Hz的光脉冲刺激，记录XXM2.0、
PsCatCh2.0的响应情况，并在重复光刺激后间隔4000 ms和200 ms来分析电流衰减情况。组间比较均采用独立样本
t检验。
结果:在XXM2.0、
PsCatCh2.0序列两端引入限制性内切酶位点EcoRⅠ和EcoRⅤ，酶切后通过T4 DNA连接酶成功构建新质粒pCIG （c）-msFoxn3-XXM2.0和pCIG (c）-msFoxn3-
PsCatCh2.0，并转染表达在HEK 293T细胞上。XXM2.0和
PsCatCh2.0均表现出光强依赖性，光强越大电流越大。在视网膜安全阈值内的光强6.4×10
14 photons/ （cm
2·s）刺激下，XXM2.0和
PsCatCh2.0仍产生较大电流，分别为（92.8±142.0）、（13.9±5.6）pA；两者比较，差异无统计学意义（
t=1.24、1.24，
P=0.28、0.29）。XXM2.0、
PsCatCh2.0的开放时间常数分别为（23.9±6.7）、（2.4±0.8）ms，关闭时间常数分别为（5 803.0±568.2）、（219.9±25.6）ms；两者比较，XXM2.0开放时间常数、关闭时间常数均较
PsCatCh2.0大，差异均有统计学意义（
t=7.10、31.60，
P=0.00、0.00 ）。在响应频率方面，XXM2.0和
PsCatCh2.0均能很好地响应32 Hz的高频率脉冲光刺激，并在较长时间（4000 ms）和较短时间（200 ms）间隔的重复光刺激后均保持较小的电流衰减率。
结论:XXM2.0和
PsCatCh2.0均可在对视网膜安全的光强条件下被激活，并都能以较低的电流衰减来响应高频率（至少32 Hz）的脉冲光刺激，均满足利用光遗传学来恢复视觉功能所需的光敏蛋白特性。

关键词：视觉，眼、光遗传学、Channelrhodopsin-XXM2.0、Channelrhodopsin- PsCatCh2.0

所属期刊栏目：36

资助基金：国家重点研发计划2017YFE0103400;National Key R&D Program of China2017YFE0103400

在线出版日期：2023-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：838-845