10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2013.12.010
9型重组腺相关病毒介导 R65核酶基因体外转染人血管不同细胞的对比研究
目的:研究9型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus 9,rAAV9)载体介导R65核酶基因及增强型绿色荧光蛋白( enhanced green fluorescent protein ,EGFP)对体外培养人脐静脉内皮细胞( human umbilical vein endothelial cells , HUVECs )、人主动脉平滑肌细胞( human aortic smooth muscle cells , HASMCs)的转染及病毒载体对两种不同细胞的增殖情况和对NF-κB通道P65表达的影响。方法 rAAV9-EGFP-R65按转染复数(multiplicity of infection,MOI)为1×105、1×106、1×107转染HUVECS、HASMCS细胞,倒置荧光显微镜下观察 HUVECs、HASMCs 细胞中EGFP 的表达,流式细胞仪检测rAAV9-EGFP-R65对HUVECs、HASMCs细胞的转染效率,Alamar Blue 检测rAAV9-EGFP-R65载体对HUVECS、HASMCs细胞增殖的影响。 Western blot法检测rAAV9-EGFP-R65对HUVECs和HASMCs两种细胞中NF-κB通道P65表达的影响。结果 rAAV9-EGFP-R65转染的荧光强度随着MOI的增加和转染时间的延长而增加。 HUVECs和HASMCs在rAAV9-EGFP-R65转染24 h后EGFP 开始表达。 HUVECs 在转染后第6天达到高峰,而HASMCs在转染后第5天达高峰。高峰表达时流式细胞术检测rAAV9-EGFP-R65对HUVECs的转染率分别为MOI=1×105组:(1.40±1.20)%,MOI=1×106组:(12.30±1.35)%,MOI=1×107组:(52.80±2.05)%。rAAV9-EGFP-R65对HASMCs的转染率分别为MOI=1×105组:(5.30±1.04)%,MOI=1×106组:(18.30±2.24)%,MOI=1×107组:(52.40±3.21)%。 rAAV9-EGFP-R65转染HUVECs和HASMCs细胞后,细胞生长及形态均正常,Alamar Blue法进一步检测表明HUVECs和HASMCs各细胞内转染组与未转染组之间A值差异均无统计学意义。 Western blot 法检测显示rAAV9-EGFP-R65转染HUVECs 和HASMCs 两种细胞后NF-κB通道P65的表达减弱。结论 rAAV9-EGFP-R65能够有效转染人脐静脉内皮细胞和人主动脉平滑肌细胞,对两种细胞增殖均无抑制作用,均能有效抑制两种细胞中NF-κB通道P65的表达。
腺相关病毒、核酶基因、转染、NF-κB、动脉粥样硬化
R65;R73
国家自然科学基金项目81160042;教育部新世纪优秀人才计划NCET-11-1074
2014-01-09(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)
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