绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的重组表达及初步活性鉴定

摘要：

目的 原核表达及纯化绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE并进行初步活性鉴定.方法 分析绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的基因序列,设计带适当酶切位点的引物,用PCR方法扩增出 FlgE的编码DNA序列,与大肠杆菌表达载体pET24a同时经Nde Ⅰ/HindⅢ双酶切、纯化及连接后构建pET24a-FlgE原核表达质粒,挑选重组阳性质粒经DNA测序确认序列正确,转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达条件优化,使重组质粒表达目的蛋白,采用组氨酸标签亲和层析法对目的蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE对纯化后蛋白相对分子质量进行鉴定,用试剂盒进行去内毒素化处理.在体外培养人角膜上皮细胞系细胞,加入纯化的FlgE重组蛋白,培养4h后应用实时定量PCR检测各种相关的炎性因子以反映FlgE蛋白活性.结果 可用于大肠杆菌表达系统的重组pET24a-FlgE构建成功,其编码的蛋白在BL21中获得高效表达,当诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷浓度为1 mmol/L,在16℃、225r/min振荡培养20 h,诱导目的蛋白表达量最高,经纯化、去内毒素处理和SDS-PAGE鉴定,获得纯化的重组FlgE蛋白.角膜上皮细胞用20 μg/ml FlgE处理后,细胞内炎性相关分子IL-6和IL-8的表达量明显上升,而灭活的FlgE蛋白则丧失该刺激活性.结论 获得纯化的重组绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE,且可刺激角膜上皮细胞上调炎性因子IL-6、IL-8的表达.

关键词：绿脓杆菌、FlgE、原核表达载体、角膜上皮细胞、炎性因子

所属期刊栏目：33

分类号：Q78;R3;S852.65

资助基金：国家重点基础研究发展计划（973计划）2009CB526506

在线出版日期：2013-07-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：112-116