增强型绿色荧光蛋白标记的重组丙型肝炎病毒体外细胞培养系统的建立

摘要：

目的 构建一个易检测且灵敏度高的丙型肝炎病毒(HCV)细胞感染模型,为HCV致病机制的研究和抗病毒药物的筛选提供一个有效的体外细胞培养体系.方法 利用重组PCR技术在HCV的非结构蛋白NS5A的C端引入优势突变点V2440L,然后在其RsrⅡ酶切位点插入增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因,基因测序及酶切鉴定重组基因序列构建成功后,体外转录获得RNA,然后转染入肝癌细胞系Huh7.5,用Western blot检测EGFP与NS5A融合蛋白,用细胞免疫荧光(IFA)检测病毒复制水平和EGFP表达情况.用RT-PCR检测转染细胞培养液不同时间点的HCV RNA水平.用IFN-α鉴定该系统用于抗丙型肝炎药物筛选的可行性.结果 在重组病毒JFH1-2440-EGFP RNA转染的细胞内可检测到EGFP的表达,EGFP表达水平与病毒复制水平一致.转染细胞的培养上清液能感染新的Huh7.5细胞,IFA结果显示转染后第9天培养上清液的病毒滴度为104 FFU/ml,提示JFH1-2440-EGFP RNA转染的细胞能释放有传染性的HCV病毒颗粒.RT-PCR检测结果显示转染细胞上清液中的HCV RNA在转染72 h后可达到3.06×105拷贝/ml,第9天可达到7.96×106拷贝/ml.EGFP的表达呈干扰素浓度依赖性.结论 构建的重组病毒HCVJFH1-2440-EGFP体外细胞培养系统具有经济、快速、敏感等优点,为HCV致病机制的研究和抗病毒药物的筛选提供了一个有效的工具.

关键词：丙型肝炎病毒、绿色荧光蛋白、报告基因、细胞培养

所属期刊栏目：32

资助基金：江苏省333工程BIA2010080

在线出版日期：2013-03-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：1034-1038