含mIL-12基因多顺反子逆转录病毒载体构建及其在肝癌细胞中的表达

摘要：

目的 构建含小鼠白细胞介素12双亚基及新霉素磷酸转移酶基因多顺反子逆转录病毒载体,并观察其在小鼠肝癌细胞中的表达.方法 利用脑心肌炎病毒(EMCV)及脊髓灰质炎(Polio)病毒内核糖体进入位点(IRES),连接mIL-12 p40及p35 cDNAs和筛选基因新霉素磷酸转移酶(NeoR),克隆至逆转录病毒载体pGCEN中,使三个基因同时受逆转录病毒载体5′端LTR启动子控制,转录至同一mRNA转录本上,通过不同机制翻译成蛋白质,从而构建成多顺反子逆转录病毒载体,即pGCEN/mIL-12.在LipofectAMINE介导下将pGCEN/mIL-12转染包装细胞PA317,G418筛选,直至出现阳性克隆,挑取抗性克隆,扩大培养,收集上清,用小鼠成纤维细胞NIH3T3测定病毒滴度.然后用重组转录病毒感染小鼠肝癌细胞MM45 T.Li,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,对阳性克隆进行鉴定.结果 由PA317包装细胞产生的重组逆转录病毒的滴度为5×105CFU/ml,将其感染小鼠肝癌细胞MM45 T.Li,后经PCR及Southern blot证明,外源基因已整合至小鼠肝癌细胞基因组中,RT-PCR及Northern blot分析外源基因在mRNA水平上的表达,并证实mIL-12 p40及p35 cDNA和NeoR基因转录在同一mRNA上.ELISA显示mIL-12的表达量48 h为10ng/106细胞.并且M45/mIL-12培养上清能刺激人外周血单个核细胞增殖及诱导小鼠脾细胞IFN-γ的产生(160U/ml).结论 利用IRES构建的含IL-12双亚基多顺反子逆转录病毒载体,能在小鼠肝细胞中稳定有效地表达,从而为利用IL-12进行肿瘤基因治疗奠定了基础.

关键词：白细胞介素12、逆转录病毒、内核糖体、mIL-2基因

所属期刊栏目：20

分类号：R3(基础医学)

资助基金：国家自然科学基金39730440

在线出版日期：2007-08-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：93-97