果蝇样受体4介导游离脂肪酸调节人血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白-1的表达

摘要：

目的 探讨软脂酸对人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMC)单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因表达的调节及果蝇样受体4(TLR4)信号通路的作用.方法 采用不同剂量的软脂酸(100、200、400 μmol/L)处理HA-VSMC 6、12、24h,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测细胞MCP-1 mRNA表达,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测MCP-1蛋白表达,观察软脂酸调节MCP-1表达的剂量依赖关系和时间效应；采用蛋白激酶C(PKC)抑制剂白屈菜红碱、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂wortmannin、神经酰胺抑制剂myriocin和核因子κB(NF-κB)抑制剂parthenolide分别处理细胞30 min,再加入软脂酸(400 μmol/L)处理细胞6h后,实时荧光定量PCR检测MCP-1 mRNA的表达水平,ELISA检测MCP-1的蛋白表达水平,研究软脂酸调节MCP-1表达依赖的信号通路；构建TLR4短发夹RNA(shRNA)腺病毒pGSadeno-TLR4并感染HA-VSMC沉默TLR4基因表达,实验同时设空白对照组(PBS缓冲液)和对照病毒(pGSadeno-GFP)组.细胞感染96 h后更换培养基,再加入软脂酸(400 μmol/L)处理细胞6h,采用实时荧光定量PCR检测MCP-1 mRNA表达水平,ELISA检测MCP-1的蛋白表达水平.提取细胞核蛋白,采用ELISA检测NF-κB p65亚基活性,观察TLR4/NF-κB通路在软脂酸调节HA-VSMC MCP-1基因表达中的作用.组间均数比较采用单因素方差分析.结果 采用软脂酸处理细胞6h后,对照组及100、200和400 μmol/L软脂酸组MCP-1 mRNA表达分别为1.00±0.02、3.30±2.84、8.21 ±4.31和11.25±2.73(F=7.57,P＜0.05)；MCP-1蛋白表达分别为(127±10)、(147±10)、(163 ±18)和(194±14)ng/L(F =7.81,P＜0.05).软脂酸可促进HA-VSMC MCP-1mRNA和蛋白表达且具有明显的剂量依赖关系.细胞培养12 h和24 h后,随着软脂酸浓度的增加,MCP-1 mRNA和蛋白表达水平呈逐渐增加趋势,但时间效应则不明显.采用不同的信号通路抑制剂和软脂酸处理细胞6h后,对照组、软脂酸组、软脂酸+parthenolide组、软脂酸+白屈菜红碱组、软脂酸+ wortmannin组和软脂酸+myriocin组MCP-1 mRNA表达分别为1.00±0.02、10.80±1.23、3.49±0.28、10.84±0.24、11.24±0.27和10.62±0.36(F=1313.07,P＜0.05)；MCP-1蛋白表达分别为(132±8)、(218±12)、(152±4)、(213±12)、(225±7)和(226±9)ng/L(F=106.83,P＜0.05).成功地构建并获得TLR4 shRNA腺病毒pGSadeno-TLR4,采用pGSadeno-TLR4感染HA-VSMC阻断TLR.信号后,软脂酸+pGSadeno-TLR4组的NF-κBp65结合活性、MCP-1 mRNA和蛋白表达均显著低于软脂酸组[分别为0.48±0.12比1.24±0.16、1.88±0.33比10.80±1.23、(154±10)比(218±12)ng/L;F =591.86、659.16、118.37,均P＜0.01].而对照病毒pGSadeno-GFP对软脂酸诱导的NF-κB p65结合活性和MCP-1表达均无明显影响.结论 TLR4/NF-κB信号通路介导了软脂酸诱导的人主动脉血管平滑肌细胞MCP-1基因表达.

关键词：人主动脉血管平滑肌细胞、软脂酸、果蝇样受体4、单核细胞趋化蛋白-1

所属期刊栏目：5

分类号：R587.1;R363;R743.31

资助基金：国家自然科学基金;甘肃省自然科学基金

在线出版日期：2013-04-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：108-113