10.3760/cma.j.cn441217-20230217-00216
基于CRISPR/Cas9技术建立 Pkd1基因条件敲除的多囊肾小鼠模型
目的:基于CRISPR/Cas9和Cre-loxP基因编辑技术建立多囊肾病1（polycystic kidney disease 1，
Pkd1）基因条件敲除小鼠模型，为深入研究
Pkd1基因在多囊肾病发生中的作用提供动物模型。
方法:采用In-Fusion技术构建打靶载体，根据
Pkd1基因制备对应的gRNA、Cas9 mRNA及携带loxP位点的供体载体，共同注射于C57BL/6N小鼠的受精卵内。将受精卵转移至有假孕状态雌性小鼠的输卵管内部。幼鼠出生后经PCR鉴定及测序分析分选出
Pkd1
flox/flox基因型F0代阳性小鼠，后者与野生型小鼠配繁，筛选出后代基因型为
Pkd1
flox/+的F1代杂合子小鼠，内部扩繁获得基因型为
Pkd1
flox/flox的F2代纯合子小鼠，该基因型小鼠再与
Cre阳性表达的
Ggt1-
Cre小鼠杂交，获得
Pkd1
flox/+Ggt1
Cre基因型的F3代小鼠，F3代自交或与F2代
Pkd1
flox/flox回交得到
Pkd1
flox/floxGgt1
Cre基因型的F4代小鼠，即肾脏特异性
Pkd1基因敲除（
Ggt1-cKO）小鼠。采用PCR法鉴定小鼠基因型，按基因鉴定结果分为野生型对照（WT）组（
n=6）、
Pkd1纯合子对照（PKD）组（
n=6）和
Ggt1-cKO敲除验证（CKO）组（
n=6）。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组小鼠肾脏和其他器官组织中
Pkd1 mRNA的表达；HE染色检查各组小鼠肾组织病理改变；自动生化检测仪检测小鼠血清尿素氮和血清肌酐含量，并计算肾脏系数。
结果:PCR检测结果显示，CKO组子代小鼠基因型符合
Pkd1
flox/floxGgt1
Cre。
Pkd1基因仅在肾脏特异性表达，其余组织中均未见表达。RT-qPCR结果显示，CKO组小鼠肾脏髓质
Pkd1 mRNA相对表达量显著低于WT组和PKD组（均
P<0.05）。肉眼可见CKO组小鼠肾脏体积较WT组增大了1倍左右，光镜下可观察到CKO组小鼠肾脏有多个大小形态不一的空泡，髓质组织间隙明显增加。CKO组小鼠肾脏系数、血清尿素氮和血清肌酐含量均显著高于WT组和PKD组（均
P<0.05）。
结论:基于CRISPR/Cas9和Cre-loxP基因编辑技术可成功构建
Pkd1基因条件敲除小鼠，为进一步研究
Pkd1基因在多囊肾病发生中的作用机制提供动物模型。
多囊肾疾病、小鼠，基因敲除、CRISPR-Cas系统、Pkd1基因 、Cre-loxP
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国家自然科学基金81960808;江西省自然科学基金面上项目20224BAB206029;江西中医药大学“校级科技创新团队发展计划”CXTD22013;江西中医药大学中西医结合一级学科（江西省双一流学科）81960808;National Natural Science Foundation of China20224BAB206029;General Program of Jiangxi Natural Science FoundationCXTD22013;Jiangxi University of Chinese Medicine "Development Plan for University-level Scientific and Technological Innovation Team";First Level Discipline of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine at Jiangxi University of Chinese Medicine Double First-class Discipline in Jiangxi Province
2024-01-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共8页
697-704
