基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的建立

摘要：

目的:建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas13a）的乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（HBV cccDNA）检测方法。方法:提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后，使用Hind Ⅲ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶（PSAD）分别进行酶切；根据松弛环状DNA（rcDNA）和cccDNA的结构差异，设计特异性扩增HBV cccDNA的引物，对酶切后的产物进行滚环扩增（RCA）和PCR扩增；并筛选crRNA，建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果:利用α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）和HBV表面抗原（HBsAg）引物对双重酶切后的产物进行扩增，验证产物中HBV基因组的存在；利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增，验证了产物中只存在HBV cccDNA；利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释，然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测，计算出检测下限为10拷贝/μl。结论:本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法，可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测，为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。

关键词：肝炎病毒，乙型、共价闭合环状DNA、规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白、微滴数字聚合酶链反应、荧光定量聚合酶链反应

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资助基金：国家自然科学基金项目No. 81770611、82002243;北京自然科学基金和北京市教委联合资助重点项目No. KZ202010025035;首都卫生发展科研专项重点攻关项目No.首发2020-1-1151、首发2021-1G-2181;北京市科技计划"首都临床诊疗技术研究及示范应用"专项课题No. Z191100006619096、Z191100006619097;北京市优秀人才培养项目No. 2018000021469G289;北京市医院管理中心"青苗"计划专项经费资助No. QML20201702

在线出版日期：2023-02-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：320-327