pH值对人真皮微血管内皮细胞成管的影响及其分子机制

摘要：

目的:探讨pH值对人真皮微血管内皮细胞（HDMEC）成管的影响并研究其分子机制，为促进创面愈合过程中血管新生的研究提供理论依据。方法:采用实验研究方法。取第4、5代对数生长期HDMEC进行实验，制备pH值分别为6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8的培养液，用其适应性培养细胞（培养方式下同）24 h后进行后续实验。另培养36 h，采用流式细胞仪测定胞质pH值的相对荧光值并对胞质pH值的相对荧光值与培养液pH值进行相关分析。另培养1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 d，采用细胞计数试剂盒8检测细胞增殖活性。采用Oris
TM细胞迁移检测试剂盒检测去掉播种塞后0（即刻）、24、48 h细胞迁移剩余面积。进行三维基质胶细胞成管实验，检测另培养48 h细胞成管的管腔直径。另培养48 h，采用蛋白质印迹法检测细胞中蛋白激酶B（Akt）磷酸化位点473、308的蛋白表达。样本数均为3。对数据行Pearson相关性分析、单因素方差分析、析因设计方差分析、重复测量方差分析与Bonferroni校正。
结果:另培养36 h，与pH值6.4培养液相比，pH值6.8~7.8培养液培养细胞胞质pH值的相对荧光值均显著升高（
P<0.05）；与pH值6.6~7.0培养液相比，pH值7.4~7.8培养液培养细胞胞质pH值的相对荧光值均显著升高（
P<0.05），且pH值6.6培养液培养细胞胞质pH值的相对荧光值明显低于pH值7.0、7.2培养液（
P值均<0.05）；pH值7.6、7.8培养液培养细胞胞质pH值的相对荧光值均显著高于pH值7.2、7.4培养液（
P<0.05）。胞质pH值的相对荧光值与培养液pH值呈显著正相关（
r=0.99，
P<0.05）。8种pH值培养液另培养1.5 d细胞增殖活性相近（
P>0.05）。另培养2.5 d，与pH值7.6培养液相比，pH值6.4~6.8培养液培养细胞增殖活性均显著下降（
P<0.05）。另培养3.5 d，与pH值6.4~6.8培养液相比，pH值7.0~7.8培养液培养细胞增殖活性均显著升高（
P<0.05）；与pH值7.6培养液相比，pH值7.0~7.4、7.8培养液培养细胞增殖活性均显著下降（
P<0.05）。另培养4.5、5.5 d，与pH值6.4培养液相比，pH值6.8~7.8培养液培养细胞增殖活性均显著升高（
P<0.05）；与pH值6.6、6.8培养液相比，pH值7.0~7.8培养液培养细胞增殖活性均显著升高（
P<0.05）。另培养4.5 d，pH值7.6培养液培养细胞增殖活性显著高于pH值7.0培养液（
P<0.05）。另培养5.5 d，与pH值7.0培养液相比，pH值7.2~7.6培养液培养细胞增殖活性均显著升高（
P<0.05）；与pH值7.2、7.4培养液相比，pH值7.6培养液培养细胞增殖活性显著升高（
P值均<0.05），pH值7.8培养液培养细胞增殖活性显著降低（
P值均<0.05）。去掉播种塞后0 h，8种pH值培养液培养细胞迁移剩余面积相近（
P>0.05）。去掉播种塞后24 h，与pH值6.4培养液相比，pH值6.6~7.8培养液培养细胞迁移剩余面积均显著缩小（
P<0.05）；与pH值6.6、6.8培养液相比，pH值7.0~7.6培养液培养细胞迁移剩余面积均显著缩小（
P<0.05）。去掉播种塞后48 h，与pH值6.4、6.6培养液相比，pH值7.0~7.8培养液培养细胞迁移剩余面积均显著缩小（
P<0.05）；pH值7.2、7.4培养液培养细胞迁移剩余面积均显著小于pH值6.8、7.0、7.8培养液（
P<0.05），均显著大于pH值7.6培养液（
P<0.05）；pH值7.6培养液培养细胞迁移剩余面积显著小于pH值6.8、7.8培养液（
P值均<0.05）。另培养48 h，pH值7.0、7.2、7.4、7.6、7.8培养液培养细胞成管的管腔直径分别为（5.0±0.5）、（7.6±0.9）、（8.5±0.7）、（11.0±0.8）、（5.3±0.8）μm，均显著长于pH值6.4培养液的（2.8±0.8）μm（
P<0.05）；pH值6.6［（4.2±0.3）μm］、6.8［（4.5±0.6）μm］、7.0、7.8培养液培养细胞成管的管腔直径均显著短于pH值7.6培养液（
P<0.05）。另培养48 h，与pH值6.4、6.6培养液相比，pH值6.8~7.8培养液培养细胞中Akt磷酸化位点473、308蛋白表达均明显升高（
P<0.05），且pH值6.6培养液培养细胞中Akt磷酸化位点308蛋白表达明显高于pH值6.4培养液（
P<0.05）；与pH值6.8培养液相比，pH值7.0、7.4~7.8培养液培养细胞中Akt磷酸化位点473蛋白表达均明显升高（
P<0.05）；与pH值7.6培养液相比，pH值7.0~7.4、7.8培养液培养细胞中Akt磷酸化位点473蛋白表达均明显降低（
P<0.05）；与pH值7.8培养液相比，pH值7.0~7.6培养液培养细胞中Akt磷酸化位点308蛋白表达均明显升高（
P<0.05）。
结论:pH值可调控HDMEC形成毛细血管的管腔直径，该调控作用与Akt的激活密切相关；7.2~7.6为构建组织工程毛细血管的适宜pH值。

关键词：氢离子浓度、毛细血管、组织工程、人真皮微血管内皮细胞、管腔直径、蛋白激酶B

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资助基金：国家自然科学基金面上项目31570986;陕西省自然科学基础研究计划2023-JC-QN-0916;General Program of National Natural Science Foundation of China31570986;Natural Science Basic Research Program of Shaanxi Province of China2023-JC-QN-0916

在线出版日期：2024-01-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：662-670