含人脂肪来源蛋白复合物的三维生物打印墨水的创面修复效应初探

摘要：

目的:探讨人脂肪来源蛋白复合物（ADPC）对人皮肤成纤维细胞（HSF）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖和迁移能力的影响，以及含ADPC的三维生物打印墨水（Bioink）在裸鼠全层皮肤缺损创面中的修复效应。方法:采用实验研究方法。收集解放军总医院2020年10月—2021年3月收治的3例行腹部皮瓣转移修补术的女性慢性创面患者（年龄29~34岁）的废弃皮下脂肪组织和同期收治的3名行腹部抽脂术的健康女性（年龄24~36岁）的废弃抽脂术脂肪组织，分别制备正常ADPC（nADPC）及抽脂术ADPC（lADPC）。采用二辛丁酸法测定2种ADPC的蛋白浓度，计算2种ADPC的提取效率，样本数均为3。取对数生长期HSF和HUVEC进行后续实验。取2种细胞均按随机数字表法（分组方法下同）分为磷酸盐缓冲液（PBS）对照组、4 μg/mL nADPC组、20 μg/mL nADPC组、100 μg/mL nADPC组和200 μg/mL nADPC组，每组5孔。PBS对照组细胞采用PBS培养，余4组分别采用含相应终质量浓度的nADPC培养。常规培养24 h，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖活力。取HSF和HUVEC，分为PBS对照组、单纯nADPC组、单纯lADPC组、单纯肿瘤坏死因子α（TNF-α）组、TNF-α+nADPC组、TNF-α+lADPC组。PBS对照组与单纯TNF-α组细胞分别加入PBS，单纯nADPC组、单纯lADPC组、TNF-α+nADPC组及TNF-α+lADPC组中分别加入终质量浓度100 μg/mL的nADPC或lADPC，单纯TNF-α组、TNF-α+nADPC组及TNF-α+lADPC组再加入终质量浓度20 ng/mL的TNF-α。进行细胞划痕试验后计算划痕后24 h细胞迁移率（样本数为3），同前检测培养24 h细胞增殖活力（样本数为5）。取明胶-海藻酸钠复合Bioink（Bioink AG），制备含100 μg/mL lADPC的Bioink AG（lADPC-Bioink AG），观察二者在室温下及冷凝后的形态和三维生物打印且交联后的形态，采用流变仪检测流变性能时记录低温成胶时间（样本数为3）。取20只8~10周龄雌性BALB/c-NU裸鼠，建立背部全层皮肤缺损创面模型后，分为常规换药组、单纯lADPC组、单纯Bioink AG组和lADPC-Bioink AG组，每组5只。常规换药组裸鼠创面仅覆盖水胶体敷料和常规换药，其余3组裸鼠创面另予相应lADPC、Bioink AG、lADPC-Bioink AG处理。从治疗0 d起，行大体观察，计算治疗2、6、10 d的创面愈合率。治疗10 d，采用苏木精-伊红染色行创面组织病理学观察。对数据行独立样本
t检验、单因素方差分析、重复测量方差分析、SNK-
q检验及LSD-
t检验。
结果:lADPC的蛋白浓度、提取效率分别为（1.306±0.011）mg/mL、（11.1±1.5）%，明显低于nADPC的（2.039±0.042）mg/mL、（22.2±2.0）%（
t=23.83、6.38，
P<0.05或
P<0.01）。培养24 h，与PBS对照组比较，100 μg/mL nADPC组和200 μg/mL nADPC组HSF（
q=6.943、6.375，
P<0.01）和HUVEC（
q=6.301、6.496，
P<0.01）增殖活力均明显下降；与100 μg/mL nADPC组比较，200 μg/mL nADPC组HSF和HUVEC增殖活力无明显变化（
P>0.05）。划痕后24 h，与PBS对照组比较，单纯nADPC组、单纯lADPC组、单纯TNF-α组HSF和HUVEC迁移率均明显降低（
q=5.642、6.645、11.480，4.772、6.298、10.420，
P<0.05或
P<0.01）；与单纯nADPC组比较，单纯lADPC组HSF和HUVEC迁移率无明显变化（
P>0.05）；与单纯TNF-α组比较，TNF-α+nADPC组、TNF-α+lADPC组HSF迁移率无明显变化（
P>0.05），HUVEC迁移率均明显升高（
q=8.585、7.253，
P<0.01）；与TNF-α+nADPC组比较，TNF-α+lADPC组HSF和HUVEC迁移率无明显变化（
P>0.05）。培养24 h，与PBS对照组比较，单纯nADPC组、单纯lADPC组、单纯TNF-α组HSF和HUVEC增殖活力均明显降低（
q=5.803、5.371、9.136，11.580、9.493、13.510，
P<0.05或
P<0.01）；与单纯nADPC组比较，单纯lADPC组HSF和HUVEC增殖活力均无明显变化（
P>0.05）；与单纯TNF-α组比较，TNF-α+nADPC组、TNF-α+lADPC组HSF（
q=14.990、10.850，
P<0.01）和HUVEC（
q=7.066、8.942，
P<0.01）增殖活力均明显升高；与TNF-α+nADPC组比较，TNF-α+lADPC组HSF和HUVEC增殖活力均无明显变化（
P>0.05）。室温及冷凝状态下，lADPC-Bioink AG比Bioink AG外观稍显浑浊；三维生物打印且交联后lADPC-Bioink AG与Bioink AG形态类似。在10 ℃时，lADPC-Bioink AG的凝固时间为（76.6±0.4）s，明显慢于Bioink AG的（74.4±0.6）s（
t=4.64，
P<0.01）。治疗2 d，常规换药组裸鼠创面渗出较多，其余3组无明显渗出；治疗8 d，lADPC-Bioink AG组裸鼠残余创面面积最小，有明显上皮覆盖。治疗2 d，lADPC-Bioink AG组裸鼠创面愈合率明显高于单纯lADPC组（
t=3.59，
P<0.05），与常规换药组、单纯Bioink AG组相近（
P>0.05）；治疗6 d，lADPC-Bioink AG组裸鼠创面愈合率明显高于常规换药组、单纯lADPC组、单纯Bioink AG组（
t=18.70、15.70、3.15，
P<0.05或
P<0.01）；治疗10 d，lADPC-Bioink AG组裸鼠创面愈合率明显高于常规换药组、单纯lADPC组（
t=12.51、4.84，
P<0.01），与单纯Bioink AG组相近（
P>0.05）。治疗10 d，lADPC-Bioink AG组裸鼠创面组织血管化程度适中，上皮化充分，愈合效果最好。
结论:抽脂术相关操作会降低ADPC蛋白浓度、提取效率等表征，但lADPC与nADPC具有相同的生物学作用，可在非炎症环境中抑制HSF与HUVEC的增殖与迁移能力，在炎症环境中提高HSF与HUVEC的增殖活力，同时提高HUVEC的迁移能力；将lADPC加入Bioink AG中后，不会明显影响Bioink AG的物理性质及打印性能，并可以提升裸鼠全层皮肤缺损创面的修复效果。

关键词：再生医学、组织工程、多蛋白复合物、三维生物打印墨水、创面修复

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资助基金：国家自然科学基金创新研究群体科学基金项目81721092;国家自然科学基金重点项目81830064;国家自然科学基金青年科学基金项目32000969，82002056;中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目2019-I2M-5-059;解放军总医院军事医学创新研究项目CX19026;王正国创伤医学发展基金会生长因子复兴计划SZYZ-TR-03;Science Fund for Creative Research Groups of National Natural Science Foundation of China81721092;Key Program of National Natural Science Foundation of China81830064;Youth Science Foundation Project of National Natural Science Foundation of China32000969, 82002056;Chinese Academy of Medical Sciences Innovation Fund for Medical Sciences2019-I2M-5-059;Military Medical Innovation Research Project of PLA General HospitalCX19026;Wang Zhengguo Foundation for Traumatic Medicine Growth Factor Rejuvenation PlanSZYZ-TR-03

在线出版日期：2023-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共13页

页码：1011-1023