成人真皮成纤维细胞中转化生长因子β 1转录调控Meox1的机制及对细胞迁移的影响

摘要：

目的:探讨成人真皮成纤维细胞(HDF-a)中转化生长因子β
1(TGF-β
1)对Meox1的转录调控机制及细胞迁移功能的影响。
方法:(1)取HDF-a系细胞，用RPMI 1640完全培养基培养(下称常规培养)，将细胞分为TGF-β
1刺激组和空白对照组。TGF-β
1刺激组细胞加入10 μL质量浓度为1 mg/μL的TGF-β
1刺激，空白对照组加入等量磷酸盐缓冲液。培养72 h，取2组部分细胞进行转录组测序，筛选出2组差异表达比值≥2且
P<0.01的基因，对差异基因进行功能富集分析与京都基因和基因组百科全书代谢途径分析，记录Meox1每百万转录本(TPM)表达值，样本数为3；取2组部分细胞，采用实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)法检测Meox1 mRNA表达，样本数为3。(2)取对数生长期HDF-a系细胞(细胞生长期下同)常规培养，分为空质粒组和Smad2过表达组、Smad3过表达组、Smad4过表达组，分别转染2 μg pcDNA3.1空质粒和各自搭载Smad2、Smad3、Smad4的pcDNA3.1质粒，转染6 h后常规培养48 h，实时荧光定量RT-PCR法检测各组细胞中Meox1 mRNA的表达，样本数为3。(3)取HDF-a系细胞常规培养，同实验(1)分组处理，常规培养72 h，采用染色质免疫共沉淀-定量PCR(ChIP-qPCR)法检测2组细胞中Smad2、Smad3和Smad4蛋白在Meox1启动子上的富集度，样本数为3。(4)取HDF-a系细胞常规培养，分为阴性干扰组、小干扰RNA(siRNA)-Smad2组、siRNA-Smad3组、siRNA-Smad4组和空质粒组、Smad2过表达组、Smad3过表达组、Smad4过表达组，分别转染50 μmol/L随机siRNA、siRNA-Smad2、siRNA-Smad3、siRNA-Smad4和2 μg pcDNA3.1空质粒及各自搭载Smad2、Smad3、Smad4的pcDNA3.1质粒，转染6 h后常规培养48 h，ChIP-qPCR法检测相应组别细胞中Smad2、Smad3和Smad4蛋白在Meox1启动子上的富集度，样本数为3。(5)取2个批次HDF-a系细胞常规培养，均分为阴性干扰组、siRNA-Meox1组、空质粒组、Meox1过表达组，分别转染50 μmol/L随机siRNA、siRNA-Meox1和2 μg pcDNA3.1空质粒、搭载Meox1的pcDNA3.1质粒，转染6 h后常规培养24 h，1个批次细胞进行划痕实验，划痕后24 h观察划痕宽度，与划痕后即刻对比划痕愈合宽度；1个批次细胞进行Transwell实验，常规培养24 h，计数迁移细胞，样本数为3。(6)2018年1月—2019年6月，陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院收治3例烧伤后8～12个月增生性瘢痕患者(男2例、女1例，年龄35～56岁)，取其术中切除的瘢痕组织和瘢痕边缘附带正常皮肤组织，行免疫组织化学染色，观察Meox1蛋白表达分布。对数据行单因素方差分析、独立样本
t检验。
结果:(1)培养72 h，2组细胞差异表达明显的基因共843个，涉及组织修复、细胞迁移、炎性细胞趋化诱导过程等功能以及肿瘤坏死因子、白细胞介素17、细胞外基质受体等潜在的信号通路；空白对照组细胞测序结果的Meox1 TPM表达值为45.9±1.9，显著低于TGF-β
1刺激组的163.1±29.5(
t＝6.88，
P<0.01)。培养72 h，空白对照组细胞Meox1 mRNA表达量为1.00±0.21，显著低于TGF-β
1刺激组的11.00±3.61(
t＝4.79，
P<0.01)。(2)培养48 h，Smad2过表达组、Smad3过表达组和Smad4过表达组细胞中Meox1 mRNA表达量分别为198.70±11.02、35.47±4.30、20.27±2.50，均显著高于空质粒组的1.03±0.19(
t＝31.07、13.80、13.12，
P<0.01)。(3)培养72 h，TGF-β
1刺激组细胞中Smad2、Smad3和Smad4蛋白在Meox1启动子上的富集度均显著高于空白对照组(
t＝12.99、41.47、29.10，
P<0.01)。(4)培养48 h，阴性干扰组细胞中Smad2蛋白在Meox1启动子上的富集度为(0.200 000±0.030 000)%，显著高于siRNA-Smad2组的(0.000 770±0.000 013)%(
t＝11.67，
P<0.01)；空质粒组细胞中Smad2蛋白在Meox1启动子上的富集度为(0.200 000±0.040 000)%，显著低于Smad2过表达组的(0.700 000±0.090 000)%(
t＝8.85，
P<0.01)。阴性干扰组细胞中Smad3蛋白在Meox1启动子上的富集度为(0.500 0±0.041 3)%，显著高于siRNA-Smad3组的(0.006 0±0.001 3)%(
t＝17.79，
P<0.01)；空质粒组细胞中Smad3蛋白在Meox1启动子上的富集度为(0.470 0±0.080 0)%，显著低于Smad3过表达组的(1.100 0±0.070 0)%(
t＝9.93，
P<0.01)。阴性干扰组细胞中Smad4蛋白在Meox1启动子上的富集度与siRNA-Smad4组相近(
t＝2.11，
P>0.05)，空质粒组细胞中Smad4蛋白在Meox1启动子上的富集度与Smad4过表达组相近(
t＝0.60，
P>0.05)。(5)划痕后24 h，siRNA-Meox1组细胞划痕愈合宽度较阴性干扰组窄，Meox1过表达组细胞划痕愈合宽度较空质粒组宽。培养24 h，阴性干扰组迁移细胞数显著多于siRNA-Meox1组(
t＝9.12，
P<0.01)，空质粒组迁移细胞数显著少于Meox1过表达组(
t＝8.99，
P<0.01)。(6)烧伤后增生性瘢痕患者瘢痕组织中Meox1蛋白表达明显高于正常皮肤组织。
结论:在HDF-a系细胞中，TGF-β
1通过Smad2/3转录调控Meox1表达，进而促进细胞迁移。

关键词：转化生长因子β 1、Smad2蛋白质、Smad3蛋白质、细胞迁移分析、Meox1、成人真皮成纤维细胞

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资助基金：国家自然科学基金81630055;重庆市基础科学与前沿技术研究专项cstc2017jcyjAX0242;军队医学科技青年培育计划20QNPY011;National Natural Science Foundation of China81630055;Chongqing Basic Science and Frontier Technology Research Projectcstc2017jcyjAX0242;Military Medical Science and Technology Youth Cultivation Plan20QNPY011

在线出版日期：2023-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：224-233