肿瘤坏死因子受体相关蛋白1对大鼠缺氧心肌细胞保护作用的机制

摘要：

目的 探讨肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(TRAP1)对大鼠缺氧心肌细胞保护作用的机制. 方法 取1～3d龄SD大鼠乳鼠,分离培养心肌细胞,用于以下实验.(1)取细胞,按随机数字表法(分组方法下同)分为TRAP1组和对照组,提取细胞总蛋白.TRAP1组细胞总蛋白加入小鼠抗大鼠TRAP1单克隆一抗,对照组细胞总蛋白加入小鼠来源的同型IgG,免疫共沉淀法和蛋白质谱分析检测TRAP1可能作用的蛋白.(2)取细胞,分为常氧空白对照组、常氧+TRAP1干扰对照组、常氧+TRAP1干扰组、常氧+TRAP1过表达对照组、常氧+TRAP1过表达组,每组1孔.常氧空白对照组细胞常规培养,后4组细胞分别加入TRAP1RNA干扰空病毒载体、TRAP1 RNA干扰腺病毒载体、TRAP1过表达空病毒载体、TRAP1过表达腺病毒载体.另取细胞,分为常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧+ TRAP1干扰对照组、缺氧+TRAP1干扰组、缺氧+TRAP1过表达对照组、缺氧+TRAP1过表达组,每组1孔.各缺氧组细胞同前对应的常氧组细胞处理后,缺氧6h.实时荧光定量RT-PCR检测各组细胞中细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(COX Ⅱ)mRNA表达.本实验重复3次.(3)取细胞,分为常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧+ TRAP1过表达对照组、缺氧+TRAP1过表达组、缺氧+TRAP1过表达+COX Ⅱ干扰对照组、缺氧+TRAP1过表达+COX Ⅱ干扰组,每组3孔.前4组细胞的处理同(2),后2组细胞分别加入COX Ⅱ RNA干扰空病毒载体、COX Ⅱ RNA干扰腺病毒载体转染后,再分别加入TRAP1过表达腺病毒载体.细胞计数试剂盒8及酶标仪检测细胞增殖活性,碘化丙啶和Hoechst 33342染色检测细胞死亡率.另取细胞,分为常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧+TRAP1干扰对照组、缺氧+TRAP1干扰组、缺氧+TRAP1干扰+COXⅡ过表达对照组、缺氧+TRAP1干扰+COX Ⅱ过表达组,每组3孔,前4组细胞的处理同(2),后2组细胞均加入TRAP1RNA干扰腺病毒载体转染后,再分别加入COX Ⅱ过表达空病毒载体、COX Ⅱ过表达腺病毒载体,同前检测细胞增殖活性和死亡率.本实验重复3次.对数据行单因素方差分析、LSD检验. 结果 (1)TRAP1组细胞有TRAP1表达,对照组细胞未见TRAP1表达.TRAP1可能作用的3个蛋白是角蛋白、COX Ⅱ和预测分子量为13×103的未知蛋白.(2)与常氧空白对照组比较,常氧+ TRAP1干扰对照组、常氧+TRAP1过表达对照组细胞COX Ⅱ mRNA表达量无明显变化(P值均大于0.05),常氧+TRAP1干扰组细胞COX Ⅱ mRNA表达量明显降低(P＜0.01),常氧+TRAP1过表达组细胞COX Ⅱ mRNA表达量明显升高(P＜0.01).缺氧空白对照组细胞COX Ⅱ mRNA表达量较常氧空白对照组明显降低(P＜0.01).与缺氧空白对照组比较,缺氧+TRAP1干扰对照组、缺氧+TRAP1过表达对照组细胞COX Ⅱ mRNA表达量无明显变化(P值均大于0.05),缺氧+TRAP1干扰组细胞COX Ⅱ mRNA表达量明显下降(P＜0.01),缺氧+ TRAP1过表达组细胞COX Ⅱ mRNA表达量明显升高(P＜0.o1).(3)常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧+ TRAP1过表达对照组、缺氧+TRAP1过表达组、缺氧+TRAP1过表达+COX Ⅱ干扰对照组、缺氧+TRAP1过表达+COX Ⅱ干扰组细胞增殖活性分别为0.498±0.022、0.303±0.018、0.313 ±0.032、0.456 ±0.031、0.448±0.034、0.335±0.026,细胞死亡率分别为(4.7±1.5)％、(24.7±3.1)％、(26.0±2.7)％、(13.3±2.5)％、(12.7±2.1)％、(21.0±1.7)％.与常氧空白对照组比较,缺氧空白对照组细胞增殖活性降低、细胞死亡率增加(P值均小于0.01).与缺氧空白对照组比较,缺氧+TRAP1过表达对照组细胞增殖活性、细胞死亡率均无明显变化(P值均大于0.05),缺氧+TRAP1过表达组细胞增殖活性升高、细胞死亡率降低(P值均小于0.o1).与缺氧+TRAP1过表达组比较,缺氧+TRAP1过表达+COX Ⅱ干扰对照组细胞增殖活性、细胞死亡率均无明显变化(P值均大于0.05),缺氧+TRAP1过表达+COX Ⅱ干扰组细胞增殖活性降低、细胞死亡率增加(P值均小于0.01).(4)常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧+TRAP1干扰对照组、缺氧+ TRAP1干扰组、缺氧+TRAP1干扰+COXⅡ过表达对照组、缺氧+TRAP1干扰+COX Ⅱ过表达组细胞增殖活性分别为0.444±0.025、0.275±0.016、0.283±0.021、0.150±0.009、0.135±0.011、0.237±0.017,细胞死亡率分别为(3.7±0.6)％、(21.0±2.7)％、(20.3±3.1)％、(31.7±2.5)％、(33.3±3.2)％、(19.3±1.5)％.与缺氧空白对照组比较,缺氧+TRAP1干扰对照组细胞增殖活性、细胞死亡率均无明显变化(P值均大于0.05).与缺氧空白对照组和缺氧+TRAP1干扰对照组比较,缺氧+ TRAP1干扰组细胞增殖活性降低、细胞死亡率增加(P值均小于0.01).与缺氧+TRAP1干扰组比较,缺氧+TRAP1干扰+COX Ⅱ过表达对照组细胞增殖活性、细胞死亡率均无明显变化(P值均大于0.05),缺氧+TRAP1干扰+COX Ⅱ过表达组细胞增殖活性升高、细胞死亡率降低(P值均小于0.01). 结论 TRAP1能够正向调节COX Ⅱ mRNA表达,COX Ⅱ是TRAP1保护缺氧心肌细胞的下游效应分子.

关键词：肌细胞,心脏、缺氧、细胞增殖、细胞死亡、肿瘤坏死因子受体相关蛋白1、细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ

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资助基金：国家自然科学基金81101426、81571898National Natural Science Foundation of China 81101426,81571898

在线出版日期：2017-01-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：744-751