增生性瘢痕成纤维细胞中羟基丙酮酸异构酶同系物结合结构域分析

摘要：

目的 了解增生性瘢痕Fb中羟基丙酮酸异构酶同系物(HYI)与P311蛋白相互作用的结合区域. 方法(1)以克隆有P311的pMD18-T质粒为模板,对P311进行PCR扩增；Trizol法提取人增生性瘢痕Fb的总RNA,对HYI进行RT-PCR扩增,采用双酶切法分别构建pGA DT7-P311和pGBKT7-HYI重组载体,PCR及测序验证.采用Prot Seale软件和HNN软件对HYI蛋白进行二级结构分析,据此结果扩增HYI-1(1 ～447 bp)、HYI-2(247 ～447 bp)、HYI-3(1 ～279 bp)、HYI-4(247 ～654 bp)片段,双酶切法构建pGBKT7-HYI-1、2、3、4重组载体,经PCR及测序验证.(2)采用醋酸锂法将酵母细胞AH109制备成感受态细胞,粗略等量分为HYI全长与HYI-1、2、3、4杂交组,以及阳性对照组和阴性对照组.采用聚乙二醇-醋酸锂法,前5组分别同时转化pGBKT7-HyI全长、各片段的重组载体与pGADT7-P311重组载体,后2组分别同时转化pGBKT7-53与pGADT7-RecT重组载体、pGBKT7-Lam与pGADT7-RecT重组载体.转化后即刻,取各组部分细胞分别涂布在缺乏亮氨酸、色氨酸、腺嘌呤及组氨酸的培养基(简称四缺培养基)上,另取各组部分细胞分别涂布在缺乏亮氨酸和色氨酸的培养基(简称二缺培养基)上,培养3～6d,观察菌株生长情况,5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷显色反应检测菌落β半乳糖苷酶表达. 结果(1)克隆出的P311片段与Genbank中P311(序号hsu36189)序列一致.与Genbank中HYI(序号AY775560)序列对比,HYI基因扩增片段在496 bp处的A替换为了G.经验证各重组载体插入片段无误.(2)计算机模拟结果显示,组成HYI蛋白的216个氨基酸中,可能形成α螺旋的氨基酸有101个,可能形成无规则卷曲的氨基酸有90个,可能形成延伸链的氨基酸有25个.(3)HYI-1、2、3、4克隆片段大小与预期相符,经验证各重组载体插入片段无误.(4)除阴性对照组菌株未见在四缺培养基上生长外,其他组菌株均在2种培养基上生长,其中HYI-2(α螺旋结构最少)、HYI-3杂交组长出菌落较少.(5)除生长在二缺培养基上的阴性对照组菌落和生长在四缺培养基上的HYI-2杂交组菌落未见β半乳糖苷酶表达外,其他在四缺培养基上长出的各组菌落均有β半乳糖苷酶表达. 结论 HYI与P311蛋白可能以α螺旋结构紧密结合,在增生性瘢痕Fb向肌成纤维细胞转分化过程中发挥重要作用.

关键词：瘢痕、成纤维细胞、双杂交系统技术、羟基丙酮酸异构酶同系物、结合结构域、P311

所属期刊栏目：28

分类号：R619.6(外科手术学)

资助基金：国家自然科学基金30872695;四川省科技厅应用基础研究项目2008JY0082

在线出版日期：2012-04-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：60-64