骨髓间充质干细胞和丝素蛋白/壳聚糖支架构建组织工程尿液流出道的研究

摘要：

目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)和丝素蛋白/壳聚糖支架构建组织工程管状移植物在兔体内进行尿流改道的可行性和有效性.方法 本研究共选取雄性SPF级新西兰大白兔36只.(1)取新西兰大白兔6只,行耳缘静脉麻醉后,提取BMSC和并进行体外培养,选取第3代BMSC,进行爬片,流式细胞仪检测细胞表面标志物;(2)另取6只新西兰大白兔,耳缘静脉麻醉后,取膀胱组织块,对尿路上皮细胞进行分离、培养及鉴定;(3)采用Transwell法,对BMSC悬液进行培养,采用免疫荧光检测诱导分化后BMSC是否向尿路上皮表型分化,同时采用蛋白质印迹法及聚合酶链式反应检测UPIa、角蛋白(CK)-18的表达情况;(4)制备丝素蛋白/壳聚糖支架,并对制备好的支架的形态、孔隙率进行评估;(5)将诱导分化14 d后的BMSC浓度调至4 x 106/mL,逐滴加入盖满整个丝素蛋白/壳聚糖支架材料,设为实验组,对照组为同样浓度的细胞悬液置于细胞培养瓶培养,取培养1、3、5、7、9 d复合物,扫描电镜观察、评估丝素蛋白/壳聚糖支架上细胞生长情况,使用噻唑蓝比色法检测细胞在支架上的增殖能力,并进行活细胞/死细胞测试;(6)取剩下的新西兰大白兔24只,随机分为实验组和对照组,每组各12只.麻醉后,分别将接种BMSC和未种BMSC的丝素蛋白/壳聚糖支架埋入实验组和对照组新西兰大白兔大网膜,网膜包裹促血管化2周后行苏木精-伊红染色,检测血管生成情况,行免疫组织化学染色观察细胞在支架表面生长情况;(7)对2组新西兰大白兔行尿流改道术,于术后1、2、4、8周进行取材,并分别行苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色,术后10周利用静脉尿路造影检测流出道通畅情况.结果 (1)分离出的BMSC呈圆形,培养3 d后以长梭状细胞形态为主;培养10 d,细胞融合度可达到90％,呈典型的纺锤样形态;获取第3代BMSC,流式细胞仪检测结果显示:约99.9％的细胞表面表达CD44和CD90,约97.0％的细胞表面不表达CD34和CD45.(2)尿路上皮细胞培养3 d,贴壁生长的细胞数目明显增多,细胞形态由类圆形变为扁平梭状,可见少量细胞集落形成;培养12 d,细胞融合度达到90％,细胞呈典型的铺路石样;CK(AE1/AE3)抗体鉴定结果显示,在荧光显微镜下可见大量多边形阳性细胞.(3)将诱导分化后的BMSC爬片行免疫荧光检测、蛋白质印迹法检测及聚合酶链式反应检测均提示:未诱导分化的BMSC不表达或低表达特异性UPIa蛋白,而诱导分化后细胞UPIa和CK-18蛋白表达上调.(4)制备好的冻干丝素蛋白/壳聚糖支架大体观察呈白色,可切成2 mm厚的薄片,扫描电镜下呈鱼网状结构,孔径大小为100～120 μm,平均孔隙率为(91.2±4.3)％.(5)培养3 d,扫描电镜可见细胞黏附在丝素蛋白/壳聚糖支架上生长,较多的细胞伪足伸出,可见细胞之间的桥接现象;噻唑蓝比色法测试结果显示:细胞与支架材料共培养1、3、5 d,对照组的细胞增殖速度明显比实验组快,培养7 d,实验组和对照组细胞的增殖速度达到平衡,培养9 d实验组的细胞增殖速度加快,超过对照组;进行活细胞/死细胞测试,可观察到支架材料上90％以上的细胞为活细胞.(6)网膜包裹管状移植物促血管化2周后取材,肉眼可见移植物表面有新生血管生成;苏木精-伊红染色提示管状移植物腔面可见薄层、稀疏尿路上皮细胞覆盖;CD31免疫组织化学染色结果表明实验组可见明显的新生血管形成.(7)实验组12只新西兰兔尿流改道后均成活,未见输尿管扩张、肾积水现象,无尿外渗,流出道未见明显瘢痕形成挛缩.对照组12只新西兰兔在尿流改道术后4周内全部死亡,尸检可见流出道腔面塌陷,流出道内表面不平滑,有较多的结晶物附着.在尿流改道术后1、2、4、8周,苏木精-伊红染色可见上皮细胞逐渐完全覆盖流出道腔面;尿流改道术后1、2、4、8周,流出道表面可见上皮CK(AE1/AE3)和尿路上皮特异性蛋白UPⅢa表达逐渐增强;进一步检测连接蛋白ZO-1的表达情况与UPⅢa类似.术后10周,免疫组织化学染色显示CD31表达阳性;静脉尿路造影提示双肾分泌功能正常,肾盂、输尿管显影好,未见明显扩张现象,造影剂能够顺利通过流出道,流出道显影较好,未见明显狭窄、向外弥散现象.结论 诱导分化后BMSC与丝素/壳聚糖支架共同构建组织工程尿液流出道是可行的,具有防止尿外渗、引流尿液的作用,为术后尿流改道提供了一种新思路.

关键词：干细胞、组织工程、尿流改道术、壳聚糖、丝素蛋白、支架材料

所属期刊栏目：16

资助基金：湖北省自然科学基金青年项目;湖北省卫生健康科研基金资助

在线出版日期：2021-04-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：6-14