骆驼蓬总碱通过诱导细胞自噬促进Tau蛋白和α-突触核蛋白的降解

摘要：

目的:探讨骆驼蓬总碱(TAH)能否诱导神经细胞自噬并促进神经毒性蛋白Tau蛋白和α-突触核蛋白(α-Syn)的降解。方法:(1)将体外培养的PC12细胞分为空白对照组及1、2.5、5、10、20、50 μg/mL TAH组，分别加入0、1、2.5、5、10、20、50 μg/mL TAH作用24 h，观察细胞形态及数目的变化，采用MTT法检测细胞存活率；(2)将PC12细胞分为空白对照组、雷帕霉素组及1、2.5、5、10、20 μg/mL TAH组，分别加入等量溶剂、50 nmol/L自噬激活剂雷帕霉素及1、2.5、5、10、20 μg/mL TAH作用4 h，采用免疫荧光染色检测细胞自噬体数；(3)将PC12细胞分为空白对照组、雷帕霉素组、10 μg/mL TAH组，分别加入等量溶剂、50 nmol/L雷帕霉素、10 μg/mL TAH作用4 h，Western blotting检测细胞p62和微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ蛋白的表达；(4)将PC12细胞分为空白对照组、氯喹组、TAH组、TAH+氯喹组，分别加入等量溶剂、50 nmol/L自噬抑制剂氯喹、10 μg/mL TAH、10 μg/mL TAH+50 nmol/L氯喹作用4 h，Western blotting检测细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达；(5)将PC12细胞分为TAH组和空白对照组，分别加入10 μg/mL TAH和等量溶剂处理4 h后，Western blotting检测细胞磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、磷酸化p70核糖体蛋白S6激酶(p-p70S6K)的表达；(6)将过表达Tau-绿色荧光蛋白(GFP)的Tet on HEK293细胞分为空白对照组、TAH组、强力霉素组、强力霉素+TAH组、强力霉素+TAH+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、强力霉素+TAH+氯喹组，后4组细胞加入200 ng/mL强力霉素处理24 h后，空白对照组加入等量溶剂，TAH组加入10 μg/mL TAH，后3组细胞分别加入10 μg/mL TAH、10 μg/mL TAH+5 mmol/L 3-MA、10 μg/mL TAH+50 nmol/L氯喹，作用24 h后在激光共聚焦显微镜下观察细胞绿色荧光强度的变化，Western blotting检测细胞Tau-GFP和LC3-Ⅱ蛋白的表达；(7)将稳定表达α-Syn的HEK293细胞分为空白对照组、氯喹组、TAH组、TAH+氯喹组，分别加入等量溶剂、50 nmol/L氯喹、10 μg/mL TAH、10 μg/mL TAH+50 nmol/L氯喹作用24 h，Western blotting检测细胞α-Syn和LC3-Ⅱ蛋白的表达。结果:(1)与空白对照组比较，20、50 μg/mL TAH组细胞存活率降低，且50 μg/mL TAH组细胞存活率低于20 μg/mL TAH组，差异均有统计学意义(
P<0.05)；(2)与空白对照组比较，雷帕霉素组、10、20 μg/mL TAH组细胞自噬体数增多，且10 μg/mL TAH组细胞自噬体数多于20 μg/mL TAH组，差异均有统计学意义(
P<0.05)，因此，选择10 μg/mL TAH用于后续实验；(3)与空白对照组比较，雷帕霉素组、TAH组细胞p62蛋白的表达均降低，LC3-Ⅱ蛋白的表达均增加，差异均有统计学意义(
P<0.05)；(4)与空白对照组比较，氯喹组、TAH组、TAH+氯喹组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达均增加，且TAH+氯喹组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达高于氯喹组，差异均有统计学意义(
P<0.05)；(5)与空白对照组比较，TAH组细胞p-mTOR、p-p70S6K的表达均降低，差异均有统计学意义(
P<0.05)；(6)强力霉素组细胞Tau-GFP蛋白的表达较空白对照组增加，强力霉素+TAH组细胞Tau-GFP蛋白的表达较强力霉素组降低，强力霉素+TAH+3-MA组、强力霉素+TAH+氯喹组细胞Tau-GFP蛋白的表达较强力霉素+TAH组增高，差异均有统计学意义(
P<0.05)。TAH组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达较空白对照组增加，强力霉素+TAH组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达较强力霉素组增加，强力霉素+TAH+3-MA组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达较强力霉素+TAH组降低，强力霉素+TAH+氯喹组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达较强力霉素+TAH组增高，差异均有统计学意义(
P<0.05)；(7)与空白对照组比较，TAH组HEK293细胞α-Syn蛋白的表达降低，LC3-Ⅱ蛋白的表达升高，差异均有统计学意义(
P<0.05)；TAH+氯喹组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达高于氯喹组，TAH+氯喹组细胞α-Syn蛋白的表达高于TAH组，差异均有统计学意义(
P<0.05)。
结论:TAH可能通过抑制mTOR/p70S6K信号通路激活神经细胞自噬，从而促进Tau和α-Syn的降解。

关键词：骆驼蓬总碱、细胞自噬、Tau蛋白、α-突触核蛋白

所属期刊栏目：20

资助基金：新疆地产中药民族药新药研发培育项目2017-02-04;Xinjiang Real Estate Traditional Chinese Medicine New Drug Research and Development Project2017-02-04

在线出版日期：2023-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：1081-1091