miR-20a/106b调控NKG2D途径介导儿童型脑干胶质瘤免疫逃逸的实验研究

摘要：

目的:探讨miR-20a/106b在儿童脑干胶质瘤(BSG)恶性进展中的作用及其机制。方法:回顾性纳入2012年1月至2017年12月天津市环湖医院(天津市脑系科中心医院)神经外科接受手术切除的13例儿童BSG患者和5例成人BSG患者。采用免疫组织化学染色法检测肿瘤组织标本中自然杀伤细胞2家族成员D(NKG2D)配体MICA的表达情况，采用生物信息学方法筛选出调控MICA的miRNA。应用人脑胶质瘤LN229和U251细胞株通过荧光素酶报告基因方法验证筛选出的miRNA与MICA的靶向调控关系，通过蛋白质免疫印迹(WB)实验检测miR-20a/106b转染LN229和U251细胞株后MICA的表达情况，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫细胞对LN229细胞株的毒性能力。通过向去胸腺幼年(3周龄)和成年(10周龄)雄性SD大鼠脑桥区立体定向注射LN229细胞株的方法制备BSG幼鼠(J-rat)和成年鼠(A-rat)模型，并根据注射细胞株不同各分为3组，依次为J-rat组、J-rat-scr组、J-rat-miR-20a/106b-d组和A-rat组、A-rat-scr组、A-rat-miR-20a/106b-u组(每组各3只)，通过免疫组织化学染色方法检测MICA的表达情况，采用MCID软件检测肿瘤的侵袭性，采用TUNEL法检测细胞凋亡。结果:成人患者的MICA总阳性表达率较儿童患者高(分别为5/5、10/13，
P<0.05)。检索结果显示，有23个可能调控MICA的microRNA，其中包括miR-20a和miR-106b。在LN229细胞株中，荧光素酶报告基因结果显示，转染pGL3-MICA-wt(野生型)质粒的荧光强度较对照组和转染pGL3-MICA-mut(突变型)质粒的强(均
P<0.05)；WB结果显示，与空白对照组和无义序列组比较，AS-miR-20a组、AS-miR-106b组及AS-miR-20a/106b组MICA的表达均增加(均
P<0.05)。上述实验在U251细胞株得到相似的结果。不同效靶比(20 ∶1，10 ∶1，5 ∶1)情况下，AS-miR-20a/106b组LDH的活性高于对照组和AS-miR-20a/106b＋ MICA mAb组(均
P<0.05)，但后两组的差异无统计学意义(均
P>0.05)。术后头颅MRI结果显示，3组幼鼠和3组成年鼠均成功制备脑干胶质瘤模型。MCID软件检测结果显示，J-rat-miR-20a/106b-d组
I值较J-rat组、J-rat-scr组均降低(均
P<0.05)；A-rat-miR-20a/106b-u组
I值较A-rat组、A-rat-scr组均增加(均
P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示，J-rat-miR-20a/106b-d组的MICA染色强度均较J-rat组和J-rat-scr组增加(均
P<0.05)，A-rat-miR-20a/106b-u组MICA的染色强度均较A-rat组和A-rat-scr组降低(均
P<0.05)。体内凋亡实验显示，J-rat-miR-20a/106b-d组的细胞凋亡指数均较J-rat组和J-rat-scr组增加(均
P<0.05)，A-rat-miR-20a/106b-u组的细胞凋亡指数较A-rat组和A-rat-scr组均降低(均
P<0.05)。
结论:miR-20a/106b通过NKG2D途经达到的免疫逃逸是导致儿童型BSG恶性度高的重要原因。

关键词：神经胶质瘤、脑干、儿童、肿瘤逃逸、自然杀伤细胞2家族成员D

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资助基金：国家自然科学基金81402079，81172399;天津市自然科学基金15JCQNJC44700;National Natural Scientific Foundation of China81402079, 81172399;Natural Science Foundation of Tianjin City15JCQNJC44700

在线出版日期：2023-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：298-306