人乳头状瘤病毒16 E6/E7基因稳定表达的永生化角质形成细胞的建立及鉴定
目的:构建人乳头状瘤病毒（HPV）16 E6/E7基因稳定表达的人永生化角质形成细胞（KC），为研究HPV16 E6/E7诱导的细胞永生化及恶性转化机制提供细胞模型。方法:两步消化法分离培养原代人包皮角质形成细胞（HFK），利用慢病毒感染技术对细胞稳定转染HPV16 E6/E7基因，连续培养30代以上，筛选出永生化KC，分为3组：①空白对照组：传代2次的原代HFK；②实验组：传代2次的原代HFK感染LV5-HPV16 E6/E7，感染细胞记录为A0代，感染后以传代次数记录（A1、A2……）；③阳性对照组：HPV16阳性宫颈癌细胞SiHa。应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western印迹实验分别检测空白对照组、实验组、阳性对照组HPV16 E6/E7 mRNA、蛋白及CK14蛋白的表达，CCK-8及Transwell Insert方法检测细胞的增殖及侵袭能力。裸鼠致瘤实验检测实验组A30、阳性对照组SiHa细胞的致瘤能力。结果:成功分离原代HFK。LV5-HPV16 E6/E7重组质粒感染原代HFK后，空白对照组细胞无荧光表达，连续传代后出现衰老表现，实验组A30细胞体积、形态较原代HFK无明显变化，且荧光表达率为100%。与空白对照组相比，实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E6 mRNA表达水平显著升高（
t值分别为7.12、8.07、6.53、5.66；
P值分别< 0.001、< 0.001、= 0.001、= 0.005）；与空白对照组相比，实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E7 mRNA表达水平也显著升高（
t值分别为3.20、4.29、3.75、4.22；
P值分别为0.024、0.008、0.013、0.014）。空白对照组未见HPV16 E6/E7蛋白的表达，而A30及SiHa细胞可见HPV16 E6/E7蛋白的表达。CCK-8实验显示，实验组A10、A20、A30细胞增殖水平显著高于空白对照组（
t值分别为6.49、7.55、9.43；
P值分别为0.003、0.002、0.001），而A1的增殖水平与空白对照组比较，差异无统计学意义（
t = 2.40，
P = 0.074）。Transwell Insert侵袭实验显示，A30不能穿过基底膜，SiHa细胞可穿过基底膜被染成蓝色。裸鼠接种A30细胞2个月后无肉眼可见肿瘤，组织学亦显示无肿瘤形成，裸鼠接种SiHa细胞后可于皮下形成肿瘤。
结论:通过采用慢病毒技术转染HPV16 E6/E7基因成功建立人永生化角质形成细胞，可作为HPV相关研究中的理想细胞模型。
人乳头瘤病毒16、角蛋白细胞、慢病毒感染、细胞系，转化、HPV16 E6/E7
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江苏省自然科学基金BK20191136;江苏省重大疾病生物资源样本库开放课题SBK202005003;北京协和医学院"中央高校基本科研业务费"项目3332019104;南京市卫生科技发展专项资金项目YKK20074;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of ChinaBK20191136;Open Project of Jiangsu Biobank of Clinical ResourcesSBK202005003;Fundamental Research Funds for the Central Universities3332019104;Nanjing Health Science and Technology Development Special FundYKK20074
2023-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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