核转录因子E2F6通过β联蛋白信号通路调控恶性黑素瘤细胞增殖和转移的机制研究

摘要：

目的:研究核转录因子E2F6在人恶性黑素瘤组织和细胞系中的表达，及其对恶性黑素瘤细胞A375增殖、迁移和侵袭的影响。方法:收集重庆市中医院2012年1月至2017年12月皮肤科确诊的50例皮肤恶性黑素瘤和30例色素痣冻存组织及石蜡切片。通过qRT-PCR分析E2F6 mRNA在人恶性黑素瘤和色素痣组织及7株恶性黑素瘤细胞系（HM、A375、WM451、WM35、SK-MEL-1、Hs-695T、MDA-MB-435s）和色素痣细胞中的表达，免疫组化和Western印迹检测E2F6、β联蛋白在人恶性黑素瘤组织中的表达。采用脂质体转染法将E2F6抑制质粒和对照质粒转染至A375细胞，通过qRT-PCR和Western印迹验证E2F6基因的敲减效率。通过CCK8、软琼脂平板克隆实验、Transwell迁移和侵袭实验、3D细胞培养实验检测E2F6基因敲减对A375细胞增殖、迁移和侵袭的影响，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率，通过Western印迹检测总β联蛋白、活化β联蛋白、c-Myc和细胞周期蛋白D1等水平。两组间比较采用
t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-
t检验；采用Pearson相关系数分析皮肤恶性黑素瘤中E2F6和β联蛋白表达的相关性。
结果:7株恶性黑素瘤细胞系E2F6 mRNA相对表达水平均高于色素痣细胞（均
P < 0.001）。qRT-PCR显示，皮肤恶性黑素瘤组织中E2F6 mRNA的相对表达（0.000 55 ± 0.000 17）高于色素痣组织（0.000 18 ± 0.000 09，
t = 3.22，
P < 0.001）。免疫组化、Western印迹显示，皮肤恶性黑素瘤组织中E2F6的相对表达水平高于色素痣组织（均
P < 0.001），而β联蛋白的相对表达水平低于色素痣组（均
P < 0.001）。相关性分析显示，恶性黑素瘤组织中E2F6蛋白与β联蛋白的表达呈负相关（免疫组化：
r = -0.56，Western印迹：
r = -0.63，均
P < 0.01）。敲减A375细胞E2F6基因后，E2F6抑制组E2F6 mRNA、蛋白相对水平低于对照组（
t = 3.38、2.76，
P < 0.001）。CCK-8实验显示，继续培养后48 h，E2F6抑制组细胞增殖能力低于对照组（
t = 4.58，
P < 0.01）；软琼脂平板实验显示，E2F6抑制组细胞相对克隆比低于对照组（
t = 2.26，
P<0.001）；迁移实验显示，E2F6抑制组穿出小室细胞数（165 ± 23）低于对照组（376 ± 22，
t = 3.14，
P < 0.01）；侵袭实验显示，E2F6抑制组穿出小室细胞数（96 ± 11）低于对照组（315 ± 31，
t = 2.12，
P < 0.01）；3D细胞培养实验显示，E2F6抑制组细胞形态发生明显变化，侵袭性伪足消失。流式细胞仪检测显示，E2F6抑制组G0-G1期细胞比例、细胞凋亡率均高于对照组（均
P < 0.001）。Western印迹显示，E2F6抑制组β联蛋白水平、活化β联蛋白水平及其下游靶基因蛋白c-Myc、细胞周期蛋白D1水平均低于对照组（
P < 0.001），P21蛋白水平高于对照组（
P<0.001）；E2F6抑制组上皮-间质转化相关分子波形蛋白、神经钙黏着蛋白水平低于对照组（
P < 0.001），而上皮钙黏着蛋白水平高于对照组（
P < 0.001）。
结论:核转录因子E2F6在恶性黑素瘤中高表达，敲减A375细胞E2F6基因可能通过拮抗β联蛋白信号抑制细胞增殖、迁移和侵袭。

关键词：黑色素瘤、E2F6转录因子、β连环素、细胞增殖、细胞凋亡、A375细胞

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资助基金：国家自然科学基金81802740;重庆市自然科学基金cstc2020jcyj-msxmX0355、cstc2020jcyj-msxmX0745;National Natural Science Foundation of China81802740;Natural Science Foundation of Chongqing of Chinacstc2020jcyj-msxmX0355, cstc2020jcyj-msxmX0745

在线出版日期：2023-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：905-913