组织蛋白酶D调控皮肤成纤维细胞降解晚期糖基化终末产物的研究

摘要：

目的 探究组织蛋白酶D(CatD)对皮肤成纤维细胞降解吞入胞内的晚期糖基化终末产物(AGE)的调控作用.方法 分别以CatB+CatL、CatD以及20S蛋白酶体的酶活性抑制剂CA074Me、天冬氨酸酶抑制剂(pepstatin A)、MG-132处理皮肤成纤维细胞,CCK8和荧光法检测细胞活性及蛋白酶活性.CA074Me、pepstatin A、MG-132组分别加入AGE-BSA孵育8h,而对照组加入磷酸盐缓冲液(PBS).孵育8h后,置换含相应抑制剂的新鲜培养基继续培养24 h,流式细胞仪检测各时间点胞内AGE-BSA平均荧光强度.以不同浓度pepstatin A(37.5、75、150 μmol/L)或PBS处理皮肤成纤维细胞,加入AGE-BSA孵育,方法同前,ELISA检测各时间点胞内AGE-BSA平均浓度,计算降解率.慢病毒转染皮肤成纤维细胞,设空白对照组、空载病毒转染组、CatD高表达慢病毒转染组,荧光显微镜观察,RT-PCR、Western印迹法和荧光法检测各组CatD mRNA和蛋白表达及酶活性.分别加入AGE-BSA孵育,处理及检测方法同前,计算降解率.结果 1μmol/L CA074Me组、75 μmol/L pepstatinA组及1μmol/L MG-132组细胞增殖活性均在90％以上,与对照组(100％)差异无统计学意义(F=1.525,P＞0.05).去除AGE-BSA 24 h后,CA074Me+ AGE-BSA组和MG-132+ AGE-BSA组胞内AGE-BSA荧光强度(275.00±10.15、259.00±11.14)均较其相应8h点荧光强度(295.00±6.56、285.67±8.74)显著下降(配对t值分别为4.778、6.154,均P＜0.05),而pepstatin A+AGE-BSA组8h和32 h点细胞内AGE-BSA荧光强度差异无统计学意义(均P＞0.05).37.5、75和150 μmol/LpepstatinA组24 h内对吞人胞内AGE-BSA的降解率分别为9.64％±1.27％、5.62％±0.47％和3.21％±0.73％,各组间差异有统计学意义(F=45.876,P＜0.05),且该降解率随pepstatin A浓度增加而降低(P＜0.05).荧光显微镜下观察,空白对照组细胞未见荧光,空载病毒转染组和CatD高表达慢病毒转染组细胞荧光阳性率均在80％以上.CatD高表达慢病毒转染组CatD mRNA、蛋白表达及活性均较另2组显著上调(均P＜ 0.05).CatD高表达慢病毒转染+AGE-BSA组24 h内AGE-BSA的降解率显著高于AGE-BSA组和空载病毒转染+AGE-BSA组(均P＜0.05).结论 CatD可促进皮肤成纤维细胞降解吞入胞内的AGE-BSA.

关键词：组织蛋白酶D、成纤维细胞、糖基化终产物、高级、降解

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在线出版日期：2018-09-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：647-652